蘿卜高溫脅迫響應(yīng)蛋白組學(xué)分析與相關(guān)基因鑒定.pdf

1、非生物脅迫包括極端溫度，干旱，水澇以及重金屬等嚴(yán)重威脅著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，而高溫作為一個(gè)破壞性的環(huán)境因子能夠降低作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。蘿卜(Raphanussativus L.)是十字花科蘿卜屬重要的蔬菜作物。高溫是蘿卜夏季生產(chǎn)和供應(yīng)的主要障礙，選育耐熱性強(qiáng)的品種，是實(shí)現(xiàn)蘿卜周年供應(yīng)的重要途徑。近年來，蘿卜熱脅迫后生理機(jī)制的研究已有報(bào)道，而熱脅迫后分子機(jī)理的研究鮮有報(bào)道。本研究采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法來分離熱脅迫前后蘿卜葉片和根不同差異表達(dá)的蛋白，

2、對(duì)分離到的不同差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行MS鑒定，并對(duì)相應(yīng)基因進(jìn)行RNA水平上的表達(dá)特性分析，對(duì)分離到的相關(guān)熱激蛋白基因進(jìn)行克隆;通過mRNA差異顯示技術(shù)，進(jìn)行熱脅迫下差異表達(dá)基因的分離鑒定，以期為有效地改善植物的耐逆性，培育耐熱性的植物品種提供依據(jù)。主要試驗(yàn)的研究結(jié)果如下:
　　 對(duì)蘿卜幼苗在人工氣候箱中進(jìn)行40℃高溫處理，處理0h、12h和24 h后，利用Tris-HCl/TCA-丙酮法和酚抽提法分別提取蘿卜葉片和根的總蛋白，采用雙

3、向電泳的方法來分離這些蛋白，使用考馬斯亮藍(lán)染色使這些蛋白點(diǎn)可視化，利用MS質(zhì)譜鑒定來進(jìn)一步鑒定和分析這些不同差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)。在蘿卜葉片中，12個(gè)高度重復(fù)不同表達(dá)的蛋白點(diǎn)成功的進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，其中5個(gè)熱激蛋白(HSP)(CPN10，HSP22, HSP17.4，HSP17.6Ⅱ, putHs42)，4個(gè)能量代謝相關(guān)蛋白(FRK，THI，LGL，OEE2)，2個(gè)氧化還原相關(guān)蛋白(L-APX)和1個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白(ANN)。應(yīng)用半定量分析

4、，對(duì)利用MS鑒定出的11個(gè)(L-APX，F(xiàn)RK，THi1，LGL，ANN，HSP22，CPN10，HSP17.4，HSP17.6Ⅱ，putHs42，OEE2)不同表達(dá)蛋白點(diǎn)的相應(yīng)基因進(jìn)行了不同處理時(shí)間下(0 h，1h，6h，12h，24 h)mRNA水平上的表達(dá)特性分析，結(jié)果表明，L-APX、FRK、THi1、LGL、ANN、HSP22、CPN10、HSP17.6Ⅱ和putHs42在處理0h、12h和24 h后和蛋白水平的表達(dá)特性一致，

5、而HSP17.4和OEE2至少在一個(gè)處理下與蛋白水平的表達(dá)特性不一致。
　　 對(duì)利用酚抽提法提取的蘿卜根的總蛋白，利用雙向電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色和MS質(zhì)譜鑒定后，共有8個(gè)高度重復(fù)不同差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)成功的進(jìn)行了MS鑒定，其中2個(gè)熱激蛋白(HSP70-2，HSP18.2)，3個(gè)氧化還原相關(guān)蛋白(GST，PDIA)，1個(gè)代謝相關(guān)蛋白(PGK)，1個(gè)表達(dá)調(diào)控相關(guān)蛋白(Ras)和1個(gè)蛋白合成相關(guān)蛋白(MRT04)。應(yīng)用半定量分析，對(duì)7

6、個(gè)(HSP70-2，MRT04，PGK，GST，RAS，HSP18.2，pDI)不同表達(dá)的蛋白點(diǎn)的相應(yīng)基因進(jìn)行了不同處理時(shí)間下(0 h，1h，6h，12h，18h，24 h)mRNA水平上的表達(dá)特性分析，結(jié)果表明，HSP70-2、MRT04、PGK、GST、RAS、HSP18.2和PDI在處理0h、12h和24 h后蛋白水平和mRNA的表達(dá)特性一致，并且不同的蛋白點(diǎn)呈現(xiàn)出不同的表達(dá)水平。
　　 采用mRNA差異顯示(DDRT-P

7、CR)技術(shù)，成功克隆了蘿卜在40℃高溫處理不同時(shí)間后差異表達(dá)的26條差異片段，其中22條是與已知或推定功能基因高度同源的差異表達(dá)基因，如光合和呼吸相關(guān)基因、代謝相關(guān)基因、脅迫響應(yīng)相關(guān)基因、蛋白結(jié)合相關(guān)基因以及表達(dá)調(diào)控子基因等，結(jié)果表明高溫脅迫下植物快速同時(shí)響應(yīng)一系列不同過程的表達(dá)，并且很多生理過程都受到了影響。
　　 利用同源克隆法，對(duì)RsHSC70、RsHSP22和RsCPN10基因進(jìn)行了克隆，分別得到了其基因組DNA和cDN

8、A全長。RsHSC70基因全長2228 bp，由1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子組成，包括1941bp的開放閱讀框(ORF)，編碼646個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為70.8 kDa，理論等電點(diǎn)為4.77。RsHSP22全長865 bp，無內(nèi)含子，包括594bp的ORF，編碼197個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為22.4 kDa，理論等電點(diǎn)為4.93。RsCPN10基因全長1172bp，由4個(gè)內(nèi)含子5個(gè)外顯子組成，包括756bp的ORF，編碼251個(gè)氨基酸，相對(duì)分