利用差異顯示與RNa-Seq技術(shù)進行蘿卜鉻脅迫響應(yīng)相關(guān)基因鑒定.pdf

1、蘿卜(RaphanussativusL.)是十字花科蘿卜屬一、二年生草本植物，是我國重要的蔬菜作物之一，具有較高的食用價值和經(jīng)濟價值。蘿卜栽培歷史悠久，品種資源豐富，在我國的種植面積位居前列，是近年來我國出口創(chuàng)匯的重要蔬菜。由于其生長適應(yīng)性強，產(chǎn)量高，肉質(zhì)根營養(yǎng)成分含量豐富，被廣泛種植于中國、日本、韓國以及東南亞—些國家。
　　鉻(Cr)是環(huán)境中生物毒性最強的重金屬元素之一，它不參與生物的結(jié)構(gòu)和代謝活動，但生物體內(nèi)積累過量鉻，會對

2、生物體造成嚴重毒害，并通過食物鏈最終危及人類的生命健康。而且鉻能夠在土壤中殘留時間長達數(shù)千年，因此近年來，無論在中國還是世界范圍內(nèi)，如何控制和減輕重金屬對環(huán)境的污染和危害已成為日益突出的問題。
　　本研究以蘿卜為供試材料，研究了24個蘿卜品種在不同濃度鉻脅迫下的基因型差異分析;利用mRNA差異顯示(DDRT-PCR)技術(shù)，進行鉻脅迫下差異表達基因的分離鑒定，為解析蘿卜對鉻的吸收轉(zhuǎn)運機理提供依據(jù);利用第二代高通量測序技術(shù)對高累積鉻蘿

3、卜品種‘Nau-RG’進行不同濃度Cr(0、800mg·L-1)處理48h時的表達譜分析，對表達譜數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，并且對GO功能顯著富集基因做了聚類分析和Pathway顯著富集代謝途徑的統(tǒng)計分析。利用相對定量PCR的方法，對其中與重金屬脅迫相關(guān)的20個基因進行驗證分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.蘿卜鉻吸收累積的基因型差異研究
　　采用水培和火焰式原子吸收光譜法，研究了24個蘿卜品種肉質(zhì)根中鉻累積的基因型差異。結(jié)果表

4、明，在400mg·L-1和800mg·L-1Cr(Ⅵ)處理下，不同基因型蘿卜吸收鉻的能力存在極顯著差異。在400mg·L-1Cr(Ⅵ)的處理下蘿卜根系鉻含量的變幅為:658.4μg·g-1-6531μg·g-1，在800mg·L-1Cr(Ⅵ)的處理下蘿卜根系鉻含量的變幅為:2095μg·g-1-8608μg·g-1。根據(jù)此結(jié)果顯示，在所研究品種中，初步鑒定'Nau-RG'為高累積基因型，而'Nau-YH'為低累積基因型。
　　2.

5、利用DDRT-PCR技術(shù)分離蘿卜鉻脅迫響應(yīng)相關(guān)基因
　　利用DDRT-PCR技術(shù)分離蘿卜品種‘Nau-XZH’在不同濃度Cr(0、50、200mg·L-1)處理后的差異表達基因，以及‘Nau-XBC’在同一濃度(800mg·L-1)不同處理時間(Oh，24h，48h)后的差異表達基因?？偣卜蛛x得到26條差異片段，這些片段中有21條與已知功能基因有較高的同源性。在所得到的21條差異片段中，有6條與逆境脅迫相關(guān)，8條與細胞和組織代謝相

6、關(guān)，5條參與轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)節(jié)，2條與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。這些結(jié)果表明鉻脅迫是—個復(fù)雜的過程，蘿卜肉質(zhì)根在鉻脅迫下很多生理過程與功能受到影響。
　　3.RNA-Seq鑒定鉻脅迫響應(yīng)相關(guān)基因
　　本研究以蘿卜為研究對象，對高累積鉻蘿卜品種‘Nau-RG’在不同濃度Cr(0、800mg·L-1)處理48h下樣品進行表達譜分析，并對表達譜數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，找出與重金屬脅迫相關(guān)的差異表達基因，對差異表達基因進行GO功能顯著富集分析以及P

7、athway顯著富集代謝途徑的統(tǒng)計分析。采用QRT-PCR的方法，對表達譜數(shù)據(jù)中參與重金屬脅迫相關(guān)的20個基因進行驗證。所得結(jié)果如下:(1)蘿卜品種‘Nau-RG’在鉻脅迫下，根中差異表達基因有2985個，其中有1424個上調(diào)基因和1561個下調(diào)基因。(2)利用AmiGO軟件對差異表達基因進行GO功能分類。GO功能顯著富集的基因主要涉及:初級代謝過程、對刺激的反應(yīng)、細胞部分、細胞內(nèi)成分組成、細胞膜、催化反應(yīng)等。(3)參考KEGG數(shù)據(jù)庫對

8、所參與的生物過程進行Pathway分析，這些基因KEGG富集分析表明主要的差異表達基因參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白質(zhì)加工，淀粉和蔗糖代謝，氨基酸代謝，谷胱甘肽代謝，細胞色素P450等。其中，一些重要的硫運輸，GSH代謝，次生代謝產(chǎn)物的生物合成，MAPK信號通路和外源物代謝的細胞色素P450和金屬硫蛋白的生物合成途徑中的酶或蛋白質(zhì)的編碼基因被激活，而這些途徑都與直接或間接通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為生物體合成金屬傳輸和解毒分子。(4)以蘿卜β-Actin作為內(nèi)

9、參基因，采用相對定量PCR方法，對表達譜數(shù)據(jù)中的20個基因的差異表達情況進行驗證，結(jié)果顯示，有17個基因的差異表達倍數(shù)關(guān)系與表達譜測序結(jié)果總體趨勢相—致，有3個表現(xiàn)出相反的趨勢。對其中7個表達一致的基因進一步進行QRT-PCR分析，驗證‘Nau-RG’在不同組織和不同濃度鉻脅迫下的表達情況，定量結(jié)果顯示，在—般情況下，根中的表達量要大于葉片中的表達量，且很多基因隨著鉻濃度的增大，表達量呈現(xiàn)出下降的趨勢。通過定量試驗最終以驗證重金屬脅迫相