RNA-Seq分析鹽逆境下棉花種子萌發(fā)基因表達(dá)動(dòng)態(tài)變化.pdf

1、棉花(Gossypium hirsutum L.)是我國(guó)最重要的農(nóng)作物之一，是農(nóng)民增收和滿足國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展需求的重要戰(zhàn)略性物資。萌發(fā)是種子生命周期的起始，對(duì)植物生命歷程具有決定性的作用，然而外界環(huán)境變化對(duì)種子萌發(fā)具有關(guān)鍵性的影響。我國(guó)6.7％以上的耕地為鹽堿地，相比其它作物，棉花對(duì)土壤鹽堿的耐受力相對(duì)較高，但含鹽量0.3%以上的土壤仍嚴(yán)重抑制棉花種子的萌發(fā)，影響其成苗率，從而成為棉花鹽堿地種植的關(guān)鍵限制因素。近年來(lái)，由于氣候變化加劇，土壤

2、鹽堿化加重，加之棉花產(chǎn)區(qū)向鹽堿程度較高的東部沿海和西北內(nèi)陸地區(qū)集中，鹽害脅迫已經(jīng)成為棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要限制因素。本研究利用我國(guó)棉花主栽品種柯字棉73為研究材料，通過(guò)分析不同鹽濃度下的萌發(fā)率，確定0.6%和0.8% NaCl作為實(shí)驗(yàn)濃度，利用RNA-Seq分析種子萌發(fā)過(guò)程中基因表達(dá)動(dòng)態(tài)變化。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析，主要獲得如下的結(jié)果：
　　1)萌發(fā)實(shí)驗(yàn)表明，外界鹽濃度為0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0

3、%、1.2%、2.0%時(shí)，柯字棉種子萌發(fā)率依次為：100.00%、83.33%、73.33%、66.67%、46.67%、10.00%、0.00%、0.00%。外界鹽濃度高于1.0%時(shí)，棉花種子幾乎不能萌發(fā)。結(jié)合棉花實(shí)際栽培環(huán)境常遇到的鹽害濃度，選取0.6%和0.8%鹽濃度作為轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)濃度。
　　2) RNA-Seq共獲得114,139,977條clean reads，其中87%的clean reads可以比對(duì)到陸地棉基因組序列

4、，以|log2(fold change)|>1（2倍以上差異表達(dá)）和 FDR≤0.001為標(biāo)準(zhǔn)，共獲得26650個(gè)差異表達(dá)的基因(Differentially expressed genes, DEGs)。
　　3)分析表明，隨著鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng)，差異表達(dá)基因數(shù)目逐漸上升；而不同鹽濃度下，同一時(shí)間點(diǎn)0.8% NaCl處理樣本差異表達(dá)基因明顯高于0.6%NaCl濃度。不同萌發(fā)時(shí)間點(diǎn)比較，0% NaCl對(duì)照組、0.6% NaCl和0.

5、8%NaCl條件下，4h和0h相比較差異基因的個(gè)數(shù)依次為：1483、315和869；8h和4h相比，差異基因個(gè)數(shù)依次為：1603、1613和942；24h和8h相比較，差異基因依次為：13625、4604和3885。相同時(shí)間點(diǎn)，不同鹽濃度處理下，和對(duì)照組相比較，0.6%和0.8%NaCl濃度條件下差異表達(dá)基因分別為：4h，914(0.6%)和1529(0.8%)；8h，625(0.6%)和1146(0.8%)；24h，10649(0.6

6、%)和15552(0.8%)。以上數(shù)據(jù)表明種子萌發(fā)過(guò)程，不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)生著不同的生理變化，需要不同類型和數(shù)量的基因調(diào)控；而萌發(fā)過(guò)程對(duì)不同濃度的鹽逆境存在相同和相異的表達(dá)調(diào)控。
　　4)轉(zhuǎn)錄因子在生物學(xué)發(fā)育、逆境響應(yīng)等過(guò)程都有重要的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)共有74個(gè)家族、1053個(gè)轉(zhuǎn)錄因子編碼基因表達(dá)發(fā)生顯著性的變化，包括ERF(138)、bHLH(103)、WRKY(93)、NAC(66)、ARF(51)、GATA(48)、MYB(44)、

7、HSF(36)、Trihelix(35)等；而且這些轉(zhuǎn)錄因子在不同的時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)不同的分布，比如4h時(shí)主要的差異轉(zhuǎn)錄因子為ERF(38)、WRKY(28)、GATA(12)等，8h時(shí)主要為WRKY(16)、HSF(12)、ERF(11)等，而24h時(shí)主要為ERF(90)、bHLH(63)、WRKY(59)等，說(shuō)明種子萌發(fā)不同的時(shí)期需要不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，而很多轉(zhuǎn)錄因子又具有相對(duì)特異性的調(diào)控功能。很多轉(zhuǎn)錄因子成員被研究報(bào)道參與植物逆境下萌發(fā)

8、或發(fā)育等調(diào)控或響應(yīng)，進(jìn)一步證明這些轉(zhuǎn)錄因子在逆境條件下種子萌發(fā)中具有重要的生物學(xué)功能。
　　5)根據(jù)基因連續(xù)時(shí)間表達(dá)特征，利用K-mean分析可以將差異表達(dá)基因分為30個(gè)聚類。對(duì)不同聚類的基因進(jìn)一步GO發(fā)現(xiàn)：聚類7、8、10與轉(zhuǎn)錄過(guò)程、DNA修復(fù)、RNA加工和泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解有關(guān)；聚類21主要富集細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；聚類1、6、12、14主要富集碳水化合物代謝、物質(zhì)運(yùn)輸、微管運(yùn)動(dòng)、新陳代謝過(guò)程；聚類4、5主要與逆境應(yīng)答過(guò)程相關(guān)；

9、聚類15、20、24、28主要參與翻譯過(guò)程；而聚類2、13主要參與蛋白質(zhì)磷酸化過(guò)程。
　　6) Pathway分析表明，萌發(fā)后4h、8h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，0.6% NaCl濃度下表現(xiàn)出差異的基因有54個(gè)，pathway顯著富集在糖代謝通路，PFP酶和PFK酶有顯著差異。0.8%NaCl濃度下表現(xiàn)出差異的基因有168個(gè)，pathway富集結(jié)果顯示次生代謝物的生物合成、谷胱甘肽代謝、蛋白質(zhì)加工、糖酵解/葡萄糖途徑、碳代謝有顯著差異。

10、兩個(gè)濃度下都有差異的基因有17個(gè)。
　　7)對(duì)差異基因在A-、D-亞基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，差異基因中，A-亞基因組表達(dá)的基因有12990個(gè)，包括509個(gè)轉(zhuǎn)錄因子；D-亞基因組表達(dá)的基因有13384個(gè)，包括534個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)這些基因pathway分析發(fā)現(xiàn)他們大多富集在相似的代謝途徑。此外，A-亞基因組有8960個(gè)同源基因、D-亞基因組有9008個(gè)同源基因表達(dá)。以上結(jié)果表明，棉花A-亞基因組和D-亞基因組對(duì)棉花耐鹽響應(yīng)不具有明顯的差異