禽呼腸孤病毒誘導SPF雞的細胞自噬及其與病毒復制的關系.pdf

1、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ARV)是家禽的重要病原之一，其感染可引起雞和火雞的病毒性關節(jié)炎、腱鞘炎等，并引起免疫抑制，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大的經濟損失。本實驗室前期已證實ARV感染能夠在體外誘導細胞自噬的產生，且自噬有利于病毒的復制，并與ARV的致病機制有關。但是，ARV感染在體內是否也能夠誘導細胞自噬及影響病毒的復制，還需要進一步驗證。
　　微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated prot

2、ein1 light chain3，LC3/Atg8）是自噬體膜上的標記性蛋白，其表達水平在某種程度上反映了自噬的程度。本研究首先用ARVGX/2010/1毒株感染1日齡SPF雞，并設立空白及陽性對照組，采集組織器官進行LC3蛋白檢測，評價ARV感染能否誘導體內細胞自噬。結果顯示，ARV感染SPF雞48h后，即在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、盲腸、法氏囊、胸腺等組織器官內出現(xiàn)了LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化，且心臟、盲腸、法氏囊的變化最為明顯。

3、進一步用透射電子顯微鏡觀察ARV感染雞的心臟、盲腸和法氏囊，可發(fā)現(xiàn)變性的線粒體和典型自噬體等超微結構的存在。上述結果說明ARV感染能夠在SPF雞體內誘導細胞自噬的發(fā)生。
　　用ARV GX/2010/1毒株感染1日齡SPF雞，分別于感染48h、72h、96h和120h后采取心臟、盲腸和法氏囊進行LC3蛋白檢測，結果顯示，感染雞的心臟、盲腸和法氏囊中LC3-Ⅱ蛋白的表達水平隨著時間的增加而增加，在72h或96h時達到高峰，96h后則

4、遞減。隨后，將采取的心臟、盲腸以及法氏囊等組織處理后感染CEF細胞，用TCID50方法進行病毒滴度的檢測，結果顯示，心臟、盲腸和法氏囊均在72h時病毒復制水平達到高峰，96h后病毒復制水平則逐漸降低，說明ARV感染SPF雞后誘導的自噬與病毒復制水平之間具有一定的時間依賴性，LC3-Ⅱ的表達水平和病毒復制水平均在病毒感染后72h或96h內顯著升高。進一步證明，ARV感染不僅能夠在雞體內誘導自噬的發(fā)生，且能利用ARV感染觸發(fā)的短暫自噬在體內

5、進行病毒的復制與擴散，使得病毒復制水平在短時間內得到提高。
　　本研究使用自噬抑制劑氯喹(CQ)對1日齡SPF雞預處理后，接種ARV GX/2010/1毒株，采集心臟、盲腸和法氏囊進行LC3蛋白檢測及病毒滴度的測定。結果顯示，ARV感染雞心臟內LC3-Ⅱ蛋白累積明顯，而盲腸和法氏囊內LC3-Ⅱ蛋白也有所累積，表明CQ能夠抑制ARV感染誘導的細胞自噬。進一步將心臟、盲腸和法氏囊處理后感染CEF細胞，用TCID50方法檢測病毒滴度，結

6、果顯示，使用CQ能抑制心臟和盲腸內ARV的復制，但在法氏囊中這種現(xiàn)象并不明顯，說明CQ能夠在抑制細胞自噬的基礎上抑制心臟和盲腸內的病毒復制。
　　總之，本研究證明ARV GX/201011毒株感染1日齡SPF雞后能夠在體內誘導自噬的發(fā)生，但這種自噬現(xiàn)象是短期的，且自噬水平與病毒的復制具有一定的時間依賴性;ARV能夠利用機體的短期自噬使得病毒滴度得到短暫的升高;使用自噬抑制劑CQ能夠導致組織器官細胞內LC3-Ⅱ蛋白的累積，并能使得病