禽呼腸孤病毒誘導細胞自噬的機制及其與病毒復制的關(guān)系.pdf

1、禽呼腸孤病毒(ARV)是家禽重要疾病之一，主要感染雞和火雞，常與其他疾病混合感染，并引起免疫抑制。雖然ARV感染已被證實可誘導宿主細胞凋亡，但ARV與其靶細胞之間的相互作用關(guān)系，需進一步研究。
　　 為了探討ARV分離株GX/2010/1感染細胞后對自噬的影響，我們首先用表達GFP-LC3融合蛋白的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細胞(Vero)和雞胚成纖維細胞(CEF)，然后再感染ARV分離株GX/2010/1，利用熒光顯微鏡觀察G

2、FP-LC3在細胞內(nèi)形成的聚點。結(jié)果顯示，ARV感染組和雷帕霉素處理組發(fā)生聚點的細胞顯著多于對照組。進一步采用透射電子顯微鏡對ARV感染的Vero細胞中形成的自噬泡進行觀察。結(jié)果顯示，經(jīng)ARV感染的Vero細胞中可觀察到許多典型自噬結(jié)構(gòu)，比如杯狀體、腫脹的線粒體、自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)等。
　　 因為LC3Ⅱ表達量通常作為自噬發(fā)生水平的標志，我們通過免疫印跡的方法檢測ARV分離株GX/2010/1感染Vero細胞和CEF細胞中LC3-

3、Ⅱ/β-Actin比值的變化，發(fā)現(xiàn)ARV感染組和雷帕霉素處理組LC3-Ⅱ/β-Actin比值均顯著升高，并在病毒感染早期促進自噬，在病毒感染晚期則抑制自噬。進一步檢測p-mTOR/β-Actin和p-Akt/β-Actin的比值，結(jié)果表明(Ⅰ)型PI3K/Akt/mTOR信號通路依賴于自噬發(fā)生。
　　 為了探討宿主細胞自噬對ARV分離株GX/2010/1復制的影響，我們對藥物誘導和抑制Vero細胞和CEF細胞自噬的條件進行優(yōu)化，

4、結(jié)果顯示100nM雷帕霉素和50μM的氯喹可分別顯著誘導和抑制宿主細胞自噬。采用以上濃度預處理Vero和CEF細胞，然后感染病毒，TCID50法測定細胞培養(yǎng)液上清中子代病毒的滴度，發(fā)現(xiàn)自噬誘導劑雷帕霉素可提高ARV分離株GX/2010/1感染宿主細胞的病毒復制水平，而自噬抑制劑氯喹則通過抑制自噬溶酶體的形成，致使病毒滴度降低。表明細胞自噬對ARV復制具有促進作用。
　　 總之，本研究證實了自噬決定ARV分離株GX/2010/1感