人巨細胞病毒UL128基因編碼蛋白的生物學功能研究.pdf

1、目的:
　　 人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)是一種普遍存在的皰疹病毒,在人群中感染率為50％-80％。正常人感染HCMV后表現(xiàn)為無癥狀的隱性或潛伏感染。而一旦人體的免疫機能發(fā)生重大變化時(如妊娠、腫瘤、HIV感染、器官移植和新生兒等),HCMV即從潛伏感染活化為繼發(fā)性的增殖感染,引起嚴重的臨床癥狀甚至致死。同時HCMV感染還可引起間質(zhì)性肺炎、肝炎、腦炎、視網(wǎng)膜、腎、神經(jīng)系統(tǒng)、腸胃系統(tǒng)的疾病。

2、隨著免疫低下人群患者的增多,HCMV感染及其引發(fā)的嚴重疾病(致盲、致死)日益受到關(guān)注。
　　 HCMV廣泛的致病性是由其病毒感染多種類型細胞的能力決定的。在免疫功能低下人群中HCMV感染的首要目標為內(nèi)皮細胞和上皮細胞。研究證明HCMVUL131A-128編碼蛋白是病毒在內(nèi)皮細胞中的復制及白細胞的播散過程中的重要決定因子。而我們在研究中發(fā)現(xiàn)UL128 ORF(opening reading frame)具有兩個大小不同的片段,分別

3、為519bp和642bp,我們將其命名為HCMV UL128-519bp和HCMV UL128-642bp,為了觀察兩個ORF片段所編碼蛋白的功能是否相同及其是否在HCMV UL131A-128編碼蛋白感染內(nèi)皮及上皮細胞過程中發(fā)揮著各自不同的作用,故而利用酵母雙雜交系統(tǒng)從人胎腦cDNA文庫中篩選與HCMVUL128-519bp和HCMV UL128-642bp編碼蛋白相互作用的蛋白,這將為研究HCMV UL128基因在內(nèi)皮細胞感染嗜性中

4、所發(fā)揮的作用及揭示HCMV先天感染致病機理、解決人巨細胞病毒先天感染的防治、減少先天畸形兒出生等醫(yī)學問題奠定基礎(chǔ)。
　　 實驗材料與方法:
　　 一、實驗材料;
　　 標本為中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病毒室保存的臨床低傳代分離株H;酵母表達質(zhì)粒pGBKT7及pACT2-Human fetus brain librar由武漢大學生命科學學院病毒學國家重點實驗室肖庚富教授惠贈:構(gòu)建表達載體的相關(guān)試劑(Takara公司)

5、;3'RACE及5'RACE試劑盒(Takara公司);酵母雙雜交實驗相關(guān)試劑(Sigma,公司);常用實驗設(shè)備如BECKMAN臺式低溫高速離心機、Perkin Elmer PCR循環(huán)儀、電穿孔儀(BioRad)、全溫振蕩培養(yǎng)箱等;常用數(shù)據(jù)庫及分析軟件如基因組數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫、凝膠成像及掃描分析軟件、引物設(shè)計軟件等。
　　 二、實驗方法;
　　 (一)HCMV UL128兩種基因片段的構(gòu)建及鑒定。
　　

6、1、從感染了人巨細胞病毒的人胚肺中提取HCMV總mRNA,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)將HCMV mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再利用PCR技術(shù)以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,從而擴增出UL128基因的兩個不同大小的片段。
　　 2、將UL128基因的兩種片段分別切膠純化后與載體pGBKT7同時進行雙酶切后再次純化并連接,篩選鑒定重組克隆(pGBKT7-UL128-519bp和pGBKT7-UL128-642bp),測序并分析。
　　

7、 (二)酵母雙雜交篩選。
　　 1、檢測重組質(zhì)粒對酵母的毒性和自激活活性;
　　 2、采用醋酸鋰法將酵母雙雜交系統(tǒng)中的重組誘餌載體一重組質(zhì)粒pGBKT7-UL128-519bp或pGBKT7-UL128-642bp與人胎腦cDNA文庫質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109中,涂布于SD/-Leu/-Trn/-His/-Ade/X-a-gal平板上,30℃培養(yǎng)至菌落長出,以X-gal篩選藍色的陽性克隆。
　　 3、回轉(zhuǎn)雜

8、交鑒定:玻璃珠法提取酵母陽性質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中TG1中進行PCR鑒定。提取質(zhì)粒分別與HCMV UL128-519bp和HCMV UL128-642bp共同轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal,不能生長作為假陽性排除。
　　 4、鑒定后的陽性克隆進行測序,經(jīng)Genbank生物信息學軟件進行BLAST分析。本篩選過程重復進行三次。
　　 結(jié)果：
　　

9、一、HCMV UL128兩種基因片段的構(gòu)建及鑒定。
　　 1、采用特異性引物擴增出HCMV UL128-519bp和HCMV UL128-642bp基因片段,片段長度分別為519bp和642bp,
　　 2、并成功將HCMV UL128的兩個不同片段克隆到酵母系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄結(jié)合域pGBKT7上,命名為pGBKT7-UL128-519bp和pGBKT7-UL128-642bp。經(jīng)SmalⅠ及SalⅠ限制性內(nèi)切酶進行酶切鑒定,測

10、序分析顯示結(jié)果與預期一致。測序結(jié)果表明融合區(qū)域的讀碼框正確并有正確的方向。經(jīng)測序證實為HCMVUL128序列且無堿基突變。
　　 二、酵母雙雜交。
　　 1、證實pGBKT7-UL128兩種質(zhì)粒對酵母細胞無毒性及自激活效應(yīng)；
　　 2、將HCMV UL128-519bp與pACT2-library共轉(zhuǎn)化酵母細胞,經(jīng)過2次重復篩選從SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板篩選出15個陽性克隆,HCMV UL

11、128-642bp與pACT2-library共轉(zhuǎn)化酵母后篩選出23個陽性克隆;
　　 3、陽性克隆中提取的pACT2-library文庫質(zhì)粒與pGBKT7-UL128質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母,均能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上生長;
　　 4、對驗證后陽性克隆質(zhì)粒測序和生物信息學分析共獲得以下候選基因:與UL128-519bp編碼蛋白相互作用的蛋白14種候選基因分別為:易位體蛋白(TSPO)、ATPa

12、se相關(guān)的蛋白酶體(PAAF1)、羥基丙酮酸異構(gòu)酶同系物(HYI)、表皮生長因子基質(zhì)蛋白2(EFEMP2)、鉀結(jié)合蛋白(TBKBP1)、核糖體蛋白(RPSA)、組織蛋白酶B(CTSB)等,其中與EFEMP2(EGF-containing fibulin-like extracellular matrixprotein2)高度同源的蛋白,其同源性為100％;而與UL128-642bp編碼蛋白相互作用的蛋白有10種候選蛋白,分別為:色氨酰-

13、轉(zhuǎn)移核糖核酸合成酶(WARS)、精脒合酶(SRM)、coactosin-1ike1(Dictyostelium)(COTL1)、Thy-1、促分泌作用的膜蛋白傳遞體(SCAMP5)、富含蛋白半胱氨酸3(CRIP3)、前mRNA調(diào)節(jié)因子(PRPF8)等,其中有13個篩選克隆與Thy-1高度同源,其同源性為99％。
　　 結(jié)論：
　　 應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)分別篩選出EFEMP2和Thy-1分別與UL128-519bp和UL12