小鼠巨細(xì)胞病毒宮內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯?pdf

1、第一部分 MCMV宮內(nèi)感染對妊娠和胎仔生長發(fā)育的影響 [目的]建立小鼠MCMV宮內(nèi)感染模型，觀察MCMV宮內(nèi)感染對妊娠結(jié)局及胎仔生長發(fā)育的影響。 [方法](1)MCMVSmith毒株體外細(xì)胞培養(yǎng)法傳毒增殖，Reed-Muench法計(jì)算病毒半數(shù)細(xì)胞感染劑量TCID50。(2)ELISA法篩查MCMVIgM、IgG雙陰性BALB/C小鼠，雌雄小鼠交配受孕后隨機(jī)選擇孕齡10～11d孕鼠分組：高、中、低病毒感染劑量組各1

2、4、12、12只，經(jīng)胎盤分別接種1×107TCID50、1×166TCID50、1×105TCID50MCMV懸液；模型對照組12只，同法注射等量無菌3％FCSDMEM培養(yǎng)液，空白對照組12只，開腹只清點(diǎn)孕囊數(shù)，不做其他特殊處理。①觀察孕鼠一般情況。②處死當(dāng)日留取母鼠血液行ELISAIgM檢測。③留取胎盤及胎仔臟器組織(腦、肺、肝臟、腎臟)，各臟器部分組織行病理學(xué)檢查，部分組織勻漿液上清體外培養(yǎng)法行病毒學(xué)分離。④部分胎盤組織RT-PCR

3、法檢測MCMVmRNA和胎仔臟器PCR法檢測MCMVDNA。⑤記錄各組母鼠妊娠進(jìn)展及結(jié)局。⑥觀察仔鼠生長發(fā)育情況，稱各組胎仔出生時(shí)體重及測量身長、頭圍。 [結(jié)論]經(jīng)胎盤接種MCMV可以建立小鼠宮內(nèi)感染動物模型；MCMV宮內(nèi)感染增加孕鼠異常妊娠發(fā)生率，嚴(yán)重影響宮內(nèi)胎仔生長發(fā)育并導(dǎo)致低出生體重及小頭畸形胎仔的發(fā)生率增高。 第二部分 MCMV感染孕鼠T淋巴細(xì)胞亞型的影響 [目的]觀察MCMV感染不同時(shí)相孕鼠T淋巴細(xì)

4、胞增殖和亞型的改變，了解孕鼠感染MCMV后機(jī)體免疫功能的變化規(guī)律。 [方法]ELISA法篩查MCMVIgM、IgG雙陰性BALB/C小鼠，雌雄小鼠交配受孕后隨機(jī)選擇孕10～11d天孕鼠分組：感染組：20只，經(jīng)胎盤接種1×106TCID50MCMV懸液；模型對照組：20只，同法注射等量無菌3％FCSDMEM培養(yǎng)液；空白對照組：20只，不做任何特殊處理的正常孕鼠。于孕第14d、17d、20d、自然分娩當(dāng)日隨機(jī)取孕鼠，①經(jīng)心臟采血行E

5、LISA檢測MCMV—IgM.②無菌取脾臟，稱取脾臟濕重并行病理學(xué)觀察。③制備脾細(xì)胞，分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，培養(yǎng)過夜取懸浮細(xì)胞，CCK-8法檢測T淋巴細(xì)胞體外增殖反應(yīng)。④流式細(xì)胞術(shù)檢測T淋巴細(xì)胞亞型CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的相對數(shù)并計(jì)算CD4+/CD8+比值。 [結(jié)論]MCMV感染孕鼠，脾臟T淋巴細(xì)胞的變化規(guī)律是：CD4+T細(xì)胞降低，CD8+T細(xì)胞升高，CD4+/CD8+比值下降，并與感染時(shí)間呈現(xiàn)出一定的時(shí)間—效

6、應(yīng)關(guān)系，機(jī)體免疫功能處于抑制狀態(tài)，此免疫抑制狀態(tài)可能是MCMV垂直傳播的免疫機(jī)制之一。 第三部分 MCMV感染對孕鼠NK細(xì)胞和CTL活性的影響 [目的]觀察MCMV感染不同時(shí)相孕鼠NK細(xì)胞和CTL活性改變，了解孕鼠感染MCMV后體內(nèi)細(xì)胞免疫功能的變化規(guī)律。 [方法]ELISA法篩查MCMVIgM、IgG雙陰性BALB/C小鼠，雌雄小鼠交配受孕后隨機(jī)選擇孕10～11d天孕鼠分組：感染組：20只，經(jīng)胎盤接種1

7、×106TCID50MCMV懸液；模型對照組：20只，同法注射等量無菌3％FCSDMEM培養(yǎng)液；空白對照組：20只，只開腹，不做其它特殊處理的正常孕鼠。于孕第14d、17d、20d、自然分娩當(dāng)日隨機(jī)取孕鼠①經(jīng)心臟采血行ELISA檢測MCMV—IgM.②制備脾細(xì)胞，分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，培養(yǎng)過夜取貼壁細(xì)胞，CCK-8法檢測NK細(xì)胞的殺傷活性。③制備脾細(xì)胞，分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，培養(yǎng)過夜取懸浮細(xì)胞，ELISPOT法檢測CTL活化