丙型肝炎病毒感染慢性化的免疫學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 慢性丙型肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。盡管目前世界范圍內(nèi)對(duì)于慢性丙肝防治理論與方法上取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，但HCV感染慢性化的免疫學(xué)機(jī)制研究的不是十分透徹，持續(xù)的病毒血癥導(dǎo)致感染后丙型肝炎肝硬化、丙型肝炎肝癌的發(fā)生。免疫應(yīng)答在丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。細(xì)胞免疫功能異?？赡苁窃斐刹《境掷m(xù)感染的主要原因之一，尤其是淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能的異常是HCV感染慢性化的重要原因。
　　 目的：
　　 研究慢

2、性丙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞上抑制性受體PD-1表達(dá)情況與健康人群的差異，及在中心記憶細(xì)胞、效應(yīng)記憶性細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞表面的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)抗病毒治療后12周、48周PD-1在CD4+、CD8+的T淋巴細(xì)胞表面及記憶性細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)情況與抗病毒治療前的差異;研究CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞在慢性丙型肝炎患者外周血分布頻率與健康人群的差異，及抗病毒治療后12周、48周其分布頻率的變化;研究HLA-A2抗原在慢性丙型肝炎

3、患者+率的高低，為進(jìn)一步進(jìn)行HCV特異性肽段刺激做準(zhǔn)備;研究基因1b型的HCVNS31406-1415及HCVNS31073-1081兩條肽段刺激慢性丙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞后，CD4+、CD8+的T淋巴細(xì)胞分泌穿孔素、顆粒酶、干擾素-γ的殺傷能力。
　　 材料和方法：
　　 1.1.選擇慢性丙型肝炎患者34例為研究對(duì)象，用肝素鈉試管收集抗病毒治療基線、抗病毒治療12周、48周時(shí)外周血標(biāo)本，應(yīng)用密度-梯段離心法提取單

4、個(gè)核細(xì)胞，依照CD45RA及CD27分子在CD4及CD8+的T淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)情況將細(xì)胞分為4群，分別是原始細(xì)胞(CD4+CD27+CD45RA+)、中心記憶細(xì)胞（CD4+CD27+CD45RA-）、效應(yīng)記憶性細(xì)胞（CD4+CD27-CD45RA-）、效應(yīng)性細(xì)胞(CD4+CD27-CD45RA+)/原始細(xì)胞(CD8+CD27+CD45RA+)、中心記憶細(xì)胞（CD8+CD27+CD45RA-）、效應(yīng)記憶性細(xì)胞（CD8+CD27-CD45

5、RA-）、效應(yīng)性細(xì)胞（CD8+CD27-CD45RA+）。將PE-CY7標(biāo)記的CD3、APC-CY7標(biāo)記的CD4、PerCP標(biāo)記的CD8、APC標(biāo)記的CD45RA、FITC標(biāo)記的CD27、PE標(biāo)記的PD-1抗體加入提取出的細(xì)胞內(nèi)，振蕩均勻，室溫，避光，孵育20min。
　　 1.2.轉(zhuǎn)移細(xì)胞至上樣管內(nèi)，在流式細(xì)胞儀檢測(cè)PD-1在各群細(xì)胞的表達(dá)情況。
　　 1.3.復(fù)蘇慢性丙型肝炎患者及健康對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞，將FITC

6、標(biāo)記的CD4及PE標(biāo)記的CD25抗體各1.5μl，先后加入準(zhǔn)備好的含有細(xì)胞的EP管內(nèi)，同時(shí)設(shè)立同型對(duì)照。
　　 1.4.經(jīng)過固定、破膜處理后加入胞內(nèi)染色劑APC-FOXP3抗體1.5μl，室溫孵育20min。
　　 1.5.轉(zhuǎn)移細(xì)胞至上樣管內(nèi)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在慢性丙型肝炎患者及健康對(duì)照人群分布頻率。
　　 2.1.同樣應(yīng)用密度-梯度離心法，選取110例CHC患者外周血標(biāo)本

7、提取單個(gè)核細(xì)胞，取FITC標(biāo)記的CD3及PE標(biāo)記的HLA-A2抗體各1.5μl加入細(xì)胞，室溫、避光孵育20min。
　　 2.2.將孵育好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至上樣管，流式細(xì)胞儀進(jìn)行HLA-A2分型檢測(cè)。
　　 3.1.將1×105/ml的細(xì)胞鋪在24孔板中，分別加入基因1b型NS31406-1415及NS31073-1081肽段和細(xì)胞共孵育24h。
　　 3.2將孔板中一組孔內(nèi)加入阻斷劑，另一組孔不加阻斷劑，孵育4-5個(gè)

8、h后收獲細(xì)胞于1.5ml的EP管中，加入PE-Cy7標(biāo)記的CD3、APC-Cy7標(biāo)記的CD4、PerCP標(biāo)記的CD8抗體各1.5μl加入EP管內(nèi)，振蕩均勻，室溫，避光，孵育20min。
　　 3.3將細(xì)胞經(jīng)過固定、破膜處理后，將未加阻斷劑的細(xì)胞加入FITC標(biāo)記的Perforin（穿孔素）、將加入阻斷劑的細(xì)胞內(nèi)加入PE標(biāo)記的Grazyme（顆粒酶）B、APC標(biāo)記的Interferon-γ抗體，室溫、避光孵育30min。
　　

9、 3.4將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至上樣管內(nèi)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4及CD8+的細(xì)胞分泌穿孔素、顆粒酶及干擾素-γ的水平
　　 結(jié)果：
　　 1.PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組(t=3.837，P=0.0007)，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組(t=2.142，P=0.043);PD-1在CD4+T淋巴的中心記憶性細(xì)胞(t=2.498，P=0

10、.0213)、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(t=5.239，P=0.0001)、效應(yīng)細(xì)胞(t=3.634，P=0.0014)表面表達(dá)均高于健康對(duì)照組;PD-1在CD8+T淋巴的中心記憶性細(xì)胞(t=3.688，P=0.0015)、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(t=3.088，P=0.0058)、效應(yīng)細(xì)胞(t=4.455，P=0.0002)表面表達(dá)均高于健康對(duì)照組。
　　 2.慢性丙型肝炎患者治療至12周時(shí)，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD4+T淋巴細(xì)

11、胞(t=4.108，P=0.0002)表面表達(dá)高于健康對(duì)照組，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞(t=2.071，P=0.0458)表面表達(dá)高于健康對(duì)照組;在CD4+中心記憶性細(xì)胞(t=2.761，P=0.0129)、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(t=2.618，P=0.0174)、效應(yīng)細(xì)胞(t=2.601，P=0.0174)表面表達(dá)均高于健康對(duì)照組;PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞的中心記憶性細(xì)胞(t=2.260

12、，P=0.0364)、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(t=4.331，P=0.0004)、效應(yīng)細(xì)胞(t=4.346，P=0.0003)表面表達(dá)均高于健康對(duì)照組。
　　 3.慢性丙型肝炎患者治療至48周時(shí)，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞(t=0.00302，P=0.9702)，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞(t=0.098，P=0.9231)表面表達(dá)與健康對(duì)照組無(wú)明顯差異;PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血

13、CD4+的中心記憶性細(xì)胞(t=1.239，P=0.2312)、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(t=0.8306，P=0.4155)、效應(yīng)細(xì)胞(t=0.5457，P=0.5920)表面表達(dá)均與健康對(duì)照無(wú)明顯差異，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8+中心記憶性細(xì)胞(t=0.9505，P=0.3544)、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(t=0.3535，P=0.7278)、效應(yīng)細(xì)胞(t=0.2533，P=0.8029)表面表達(dá)均與健康對(duì)照無(wú)明顯差異;與慢性丙型肝炎患

14、者治療至12周時(shí)比較，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD4+中心記憶性細(xì)胞(t=2.441，P=0.0252)、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(t=2.852，P=0.0095)、效應(yīng)細(xì)胞(t=3.079，P=0.0065)表面表達(dá)明顯降低;與慢性丙型肝炎患者治療至12周時(shí)比較，PD-1在慢性丙型肝炎患者外周血CD8+中心記憶性細(xì)胞(t=4.849，P=0.0001)、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(t=6.723，P=0.0001)、效應(yīng)細(xì)胞(t=7.569，

15、P=0.0001)表面表達(dá)明顯降低。
　　 4.CD4+CD25+Foxp3+Treg在慢性丙型肝炎患者外周血分布頻率高于健康對(duì)照組(t=3.569,P=0.002)。
　　 5.慢性丙型肝炎患者抗病毒治療至12周時(shí)CD4+CD25+Foxp3+Treg外周血分布頻率仍高于健康對(duì)照組(t=2.696，P=0.0132)。
　　 6.慢性丙型肝炎患者抗病毒治療至48周時(shí)CD4+CD25+Foxp3+Treg外周血分

16、布頻率與抗病毒治療前基線(t=3.407，P=0.0028)、治療至12周時(shí)(t=2.565，P=0.0152)比較明顯降低。
　　 7.慢性丙型肝炎患者抗病毒治療基線外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg分布頻率與HCVRNA載量呈正相關(guān)(r=0.6.98，P=0.0016)。
　　 8.HLA-A2抗原陽(yáng)性率在慢性丙型肝炎患者中分布+率與健康對(duì)照組無(wú)明顯差異，陽(yáng)性率為39.09％。
　　 9.慢性丙型肝

17、炎患者外周血CD4+T細(xì)胞經(jīng)NS31406-1415肽段刺激后分泌顆粒酶B(t=2.0807，P=0.0229)干擾素-γ(t=2.561，P=0.0307)及穿孔素(t=4.767，P=0.001)的水平較健康對(duì)照人群明顯降低;慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T細(xì)胞經(jīng)NS31406-1415肽段刺激后分泌顆粒酶B(t=2.229，P=0.0499)干擾素-γ(t=4.598，P=0.0018)及穿孔素(t=2.387，P=0.0408)

18、的水平較健康對(duì)照人群明顯降低;慢性丙型肝炎患者外周血CD4+T細(xì)胞經(jīng)NS31073-1081肽段刺激后分泌顆粒酶B(t=2.564，P=0.0334)、干擾素-γ(t=2.633，P=0.003)及穿孔素(t=2.564，P=0.0334)的水平較健康對(duì)照人群明顯降低;慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T細(xì)胞經(jīng)NS31073-1081肽段刺激后分泌顆粒酶B(t=3.008，P=0.0148)、干擾素-γ(t=2.922，P=0.0192)及

19、穿孔素(t=2.818，P=0.0201)的水平較健康對(duì)照人群明顯降低。
　　 10.與健康對(duì)照組相比較，慢性丙型肝炎患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞增殖能力低下，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與健康對(duì)照組相比較，慢性丙型肝炎患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞增殖能力低下，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.PD-1在慢性丙型肝炎患者治療前基線表達(dá)于外周血CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞表面及CD4+T淋巴細(xì)胞、

20、CD8+T淋巴細(xì)胞中心記憶細(xì)胞、效應(yīng)記憶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞水平明顯高于健康對(duì)照組，經(jīng)抗病毒治療后連續(xù)觀察抗病毒治療至12周、48周PD-1在上述各群細(xì)胞表達(dá)明顯降低，抑制性分子的表達(dá)上調(diào)反應(yīng)了慢性丙型肝炎患者體內(nèi)T細(xì)胞功能的缺陷。
　　 2.外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg分布頻率經(jīng)抗病毒治療后亦呈現(xiàn)進(jìn)行性減少趨勢(shì)，CD4+CD25+Foxp3+Treg可能參與了HCV感染慢性化的發(fā)病過程。
　　 3.經(jīng)HCV特