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文檔簡介
1、戊型肝炎病毒(HEV)不穩(wěn)定易降解,難以從載毒標本中分離,而迄今為止仍沒有有效的細胞培養(yǎng)模型,這很大程度上限制了HEV感染致病機制的研究。近年來,隨著對HEV研究的深入,較好模擬了HEV病毒農殼表面結構的重組蛋白為研究HEV與宿主細胞相互作用提供了一條新的途徑。 HEV衣殼由單一蛋白(pORF2)組成,大量研究表明pORF2的重組表達片段p239(aa368—606)很好地模擬了HEV的免疫優(yōu)勢中和表位。p239對HEV與原代肝
2、細胞、HepG2細胞的吸附阻斷,p239對多株細胞系具有與HEV相似的嗜性,以及多株HEV特異單抗對p239與HepG2細胞結合的特異阻斷,強有力地提示p239同時也很好地模擬了HEV與細胞膜的結合所具備的表面結構特征。因此,p239與HepG2細胞的吸附模型是探討HEV與細胞膜相互作用的可靠工具。 不同結合區(qū)域的HEV單抗及其Fab片段對p239吸附細胞的阻斷結果提示,p239表面至少存在兩個細胞受體結合區(qū)域:其一為HEV的主
3、要免疫優(yōu)勢中和表位(ORF2aa459—606),另一個區(qū)域為aa423—438。這兩個區(qū)域均對p239與細胞的特異性吸附有貢獻,均能單獨介導p239與嗜性細胞的吸附,但aa459—606區(qū)域吸附細胞的能力要明顯強于后者,是介導p239吸附的主要部位。aa423—438區(qū)域與細胞表面作用力弱,在HEV結合過程中很可能只是增加病毒與主要受體結合的機會。 缺失了aa423—438的p239突變體△239保留了免疫優(yōu)勢中和表位,與p2
4、39一樣均能阻斷天然HEV對HepG2細胞的感染吸附。而喪失免疫優(yōu)勢表位的233N則不能有效阻斷。此結果表明HEV與嗜性細胞的結合很可能同p239與HepG2細胞之間的結合一樣,也是通過這兩個區(qū)域,并且主要免疫優(yōu)勢區(qū)域(ORF2aa459—606)在HEV與細胞結合過程中發(fā)揮主要作用。 通過酵母雙雜交,從人肝細胞cDNA文庫中篩出四個可能與HEV衣殼蛋白相結合的蛋白:肝細胞藥物代謝酶(p450)、轉化相關蛋白(TRP13)、p3
5、8相結合蛋白(p38IP)、DDAH2。并通過免疫共沉淀初步驗證了p38IP與E2的結合,提示HEVORF2激活MAPKp38通路的可能。 通過親和層析篩選HepG2、猴肝組織中與p239相結合的蛋白,并利用二維電泳(2—DE)結合生物質譜技術分離鑒定這些結合蛋白,得到6個可能與p239相互作用的蛋白:HSP90、GRP78/Bip、alphatubulin、P43、ATPasebetasubunit、某未命名蛋白。并通過免疫共
6、沉淀、細胞共定位等多種實驗手段進一步驗證了GRP78/Bip、HSP90與p239的結合。結果表明,GRP78/Bip與p239、HSP90與p239在HepG2細胞內共定位。并且p239與E.coli表達經純化的GRP78/Bip可直接結合,提示它們在細胞內的相互作用不是經由第三者為中介的結合。同時,ATP的加入會導致p239與GRP78/Bip結合的可逆解離,提示p239與GRP78/Bip的結合是ATP依賴的特異性結合,GRP78
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