戊型肝炎病毒感染機(jī)制初步研究.pdf

1、戊型肝炎病毒(HEV)不穩(wěn)定易降解，難以從載毒標(biāo)本中分離，而迄今為止仍沒有有效的細(xì)胞培養(yǎng)模型，這很大程度上限制了HEV感染致病機(jī)制的研究。近年來，隨著對HEV研究的深入，較好模擬了HEV病毒農(nóng)殼表面結(jié)構(gòu)的重組蛋白為研究HEV與宿主細(xì)胞相互作用提供了一條新的途徑。 HEV衣殼由單一蛋白(pORF2)組成，大量研究表明pORF2的重組表達(dá)片段p239(aa368—606)很好地模擬了HEV的免疫優(yōu)勢中和表位。p239對HEV與原代肝

2、細(xì)胞、HepG2細(xì)胞的吸附阻斷，p239對多株細(xì)胞系具有與HEV相似的嗜性，以及多株HEV特異單抗對p239與HepG2細(xì)胞結(jié)合的特異阻斷，強(qiáng)有力地提示p239同時(shí)也很好地模擬了HEV與細(xì)胞膜的結(jié)合所具備的表面結(jié)構(gòu)特征。因此，p239與HepG2細(xì)胞的吸附模型是探討HEV與細(xì)胞膜相互作用的可靠工具。 不同結(jié)合區(qū)域的HEV單抗及其Fab片段對p239吸附細(xì)胞的阻斷結(jié)果提示，p239表面至少存在兩個(gè)細(xì)胞受體結(jié)合區(qū)域：其一為HEV的主

3、要免疫優(yōu)勢中和表位(ORF2aa459—606)，另一個(gè)區(qū)域?yàn)閍a423—438。這兩個(gè)區(qū)域均對p239與細(xì)胞的特異性吸附有貢獻(xiàn)，均能單獨(dú)介導(dǎo)p239與嗜性細(xì)胞的吸附，但aa459—606區(qū)域吸附細(xì)胞的能力要明顯強(qiáng)于后者，是介導(dǎo)p239吸附的主要部位。aa423—438區(qū)域與細(xì)胞表面作用力弱，在HEV結(jié)合過程中很可能只是增加病毒與主要受體結(jié)合的機(jī)會(huì)。 缺失了aa423—438的p239突變體△239保留了免疫優(yōu)勢中和表位，與p2

4、39一樣均能阻斷天然HEV對HepG2細(xì)胞的感染吸附。而喪失免疫優(yōu)勢表位的233N則不能有效阻斷。此結(jié)果表明HEV與嗜性細(xì)胞的結(jié)合很可能同p239與HepG2細(xì)胞之間的結(jié)合一樣，也是通過這兩個(gè)區(qū)域，并且主要免疫優(yōu)勢區(qū)域(ORF2aa459—606)在HEV與細(xì)胞結(jié)合過程中發(fā)揮主要作用。 通過酵母雙雜交，從人肝細(xì)胞cDNA文庫中篩出四個(gè)可能與HEV衣殼蛋白相結(jié)合的蛋白：肝細(xì)胞藥物代謝酶(p450)、轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白(TRP13)、p3

5、8相結(jié)合蛋白(p38IP)、DDAH2。并通過免疫共沉淀初步驗(yàn)證了p38IP與E2的結(jié)合，提示HEVORF2激活MAPKp38通路的可能。 通過親和層析篩選HepG2、猴肝組織中與p239相結(jié)合的蛋白，并利用二維電泳(2—DE)結(jié)合生物質(zhì)譜技術(shù)分離鑒定這些結(jié)合蛋白，得到6個(gè)可能與p239相互作用的蛋白：HSP90、GRP78/Bip、alphatubulin、P43、ATPasebetasubunit、某未命名蛋白。并通過免疫共

6、沉淀、細(xì)胞共定位等多種實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)一步驗(yàn)證了GRP78/Bip、HSP90與p239的結(jié)合。結(jié)果表明，GRP78/Bip與p239、HSP90與p239在HepG2細(xì)胞內(nèi)共定位。并且p239與E．coli表達(dá)經(jīng)純化的GRP78/Bip可直接結(jié)合，提示它們在細(xì)胞內(nèi)的相互作用不是經(jīng)由第三者為中介的結(jié)合。同時(shí)，ATP的加入會(huì)導(dǎo)致p239與GRP78/Bip結(jié)合的可逆解離，提示p239與GRP78/Bip的結(jié)合是ATP依賴的特異性結(jié)合，GRP78