慢性丙型肝炎個(gè)體化治療策略及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus，HCV)感染呈全球性流行，感染人數(shù)達(dá)1.8億，我國HCV抗體陽性率約為3.2％。HCV感染后50％～80％發(fā)展為慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC），感染HCV20年后，肝硬化的年發(fā)生率為10％～15％，一旦發(fā)展為肝硬化，每年肝癌的發(fā)生率為1％～7％，嚴(yán)重危害人類健康。
　　 干擾素(interferon，IFN)聯(lián)合利巴韋林(ribavirin，RBV)

2、為目前國際公認(rèn)的有效抗HCV方案，標(biāo)準(zhǔn)療程(HCV基因2型、3型丙肝患者治療24周，基因1型患者治療48周)治療基因2型、3型獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response，SVR)率為55％～60％，基因1型為CHC難治的因素之一，SVR率僅為38％～41％。我國HCV感染以中老年患者居多，部分患者已進(jìn)展為肝硬化或合并其他系統(tǒng)疾病，而且，因?yàn)楦蓴_素及利巴韋林治療的副作用，臨床上約有30～40％的CHC

3、患者不能耐受標(biāo)準(zhǔn)治療方案而延誤治療，導(dǎo)致病情的進(jìn)展，因此，亟待探索適于不同人群的CHC個(gè)體化治療方案。
　　 宿主固有免疫和獲得性免疫狀態(tài)與慢性HCV感染及抗病毒治療應(yīng)答相關(guān)，尤其治療前后細(xì)胞免疫功能的變化是影響治療后早期及持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的重要因素。外周血單核細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞免疫分子表達(dá)水平的觀察可能有助于抗病毒治療方案的優(yōu)化，主要包括正向免疫調(diào)節(jié)因子單核細(xì)胞Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)的表達(dá)，

4、負(fù)向免疫調(diào)節(jié)因子T細(xì)胞程序性死亡受體-1(programmed death-1，PD-1)的表達(dá)以及負(fù)向免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)的比率變化。另外，T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（T cell immunoglobulin and mucindomain-3，Tim-3）/半乳糖凝集素-9(Galectin-9，Gal-9)系統(tǒng)也在HCV感染過程中發(fā)揮重要的免疫抑制作用。探明免疫分子變化趨勢(shì)

5、及其調(diào)節(jié)機(jī)制將有助于預(yù)測(cè)慢性HCV感染的抗病毒治療應(yīng)答及預(yù)后。
　　 我們結(jié)合我國慢性丙型肝炎發(fā)病特點(diǎn)及免疫狀況，探討適于不同人群的個(gè)體化治療方案，并通過觀察治療前后細(xì)胞免疫功能的變化和體外細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)實(shí)驗(yàn)，明確干擾素治療前、治療中相關(guān)免疫指標(biāo)變化與治療效果的關(guān)系，為CHC免疫調(diào)節(jié)療法的的研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　 第一部分：慢性丙型肝炎個(gè)體化抗病毒方案的臨床研究
　　 目的:探討適于中國人群慢性HCV感染的個(gè)體

6、化抗病毒治療方案，改善患者依從性、提高臨床治愈率。
　　 方法:采用前瞻、開放性臨床研究，選擇2010年1月～2012年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院、石家莊市第五醫(yī)院、中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院、邢臺(tái)市人民醫(yī)院、邯鄲市傳染病醫(yī)院住院CHC患者280例，記錄患者感染途徑。根據(jù)患者年齡（＜65歲或≥65歲）、體重（＜60kg或≥60kg）、合并疾病狀態(tài)（是否有肝硬化、糖尿病、心臟疾病、甲狀腺疾病等）及患者經(jīng)濟(jì)承受能力選擇不同劑

7、量、類型干擾素聯(lián)合利巴韋林治療的個(gè)體化方案。研究包括IFNα-2b和PegIFNα-2a組，每組根據(jù)應(yīng)用干擾素劑量又分為小劑量組和常規(guī)劑量組，根據(jù)治療過程中完全病毒學(xué)應(yīng)答時(shí)間確定療程。對(duì)比分析不同治療方案病毒學(xué)應(yīng)答率和不良反應(yīng)發(fā)生情況，以及HCV基因型與病毒學(xué)應(yīng)答的關(guān)系。
　　 結(jié)果:輸血/血制品感染者203例(72.5％)，30例(10.7％)為其他途徑感染包括手術(shù)/外傷、拔牙、針灸或內(nèi)鏡檢查等侵襲性操作、穿耳洞等，47例(1

8、6.8％)感染途徑不明。IFNα-2b組(n=171)快速病毒學(xué)應(yīng)答(rapid virological response，RVR)、完全早期病毒學(xué)應(yīng)答(complete early virological response，cEVR)、持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response，SVR)和不良反應(yīng)率依次為52.0％，71.3％、57.9％和7.0％，PegIFNα-2a組(n=109)為69.7％、8

9、9.9％、74.1％和8.3％,PegIFNα-2a組RVR、cEVR率顯著高于IFNα-2b組（P＜0.01）。IFNα-2b小劑量組(n=68)RVR、cEVR、SVR和不良反應(yīng)率分別為44.1％、69.1％、57.1％和10.3％，IFNα-2b常規(guī)劑量組(n=103)分別為57.3％、72.8％、60.0％和4.9％，兩組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。PegIFNα-2a小劑量組(n=48)RVR、cEVR、SVR和不

10、良反應(yīng)率分別為66.7％、85.4％、68.8％和12.5％，在PegIFNα-2a常規(guī)劑量組(n=61)分別為72.1％、93.4％、81.8％和4.9％，兩組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。發(fā)生代償期肝硬化CHC患者(n=16)RVR、cEVR和不良反應(yīng)發(fā)生率分別為31.3％、81.3％和6.3％，未發(fā)展為肝硬化患者(n=264)分別為60.6％、78.4％和7.6％，其RVR率顯著高于代償期肝硬化患者(P＜0.05)。14

11、6例進(jìn)行HCV基因型檢測(cè)的CHC患者中，1b型占62.3％。HCV基因1型感染者RVR、cEVR和不良反應(yīng)發(fā)生率分別為53.2％、71.6％和8.3％，非HCV基因1型感染者分別為86.5％、83.8％和8.1％，非HCV基因1型感染者獲得RVR率顯著高于HCV基因1型感染者(P＜0.001)。
　　 結(jié)論:根據(jù)CHC患者基線特征、合并基礎(chǔ)疾病情況及治療過程中病毒學(xué)應(yīng)答出現(xiàn)時(shí)間制定個(gè)體化治療方案，可提高患者耐受性和依從性，獲得較

12、高病毒學(xué)應(yīng)答率，改善預(yù)后。
　　 第二部分：Tregs及表達(dá)PD-1、TLRs細(xì)胞亞群與慢性HCV感染及治療應(yīng)答關(guān)系的研究
　　 目的:探明CHC患者干擾素治療前、治療過程中外周血細(xì)胞不同細(xì)胞亞群免疫相關(guān)分子的表達(dá)變化及其與病毒學(xué)應(yīng)答的關(guān)系。
　　 方法:選擇18～65歲CHC患者70例，IFNα-2b聯(lián)合利巴韋林(IFNα-2b/RBV)治療者37例，PegIFNα-2a聯(lián)合利巴韋林(PegIFNα-2a/RB

13、V)治療者33例，療程48～72周。另選擇性別、年齡與CHC患者匹配的健康體檢者20例作為對(duì)照組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組及CHC患者不同治療組在治療前、治療第12、24、48周時(shí)外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞、表達(dá)PD-1的CD4+和CD8+T細(xì)胞、表達(dá)TLR2、TLR3、TLR4的CD14+單核細(xì)胞比率變化，并分析其與cEVR的關(guān)系。
　　 結(jié)果:CHC患者外周血基線Treg細(xì)胞(P＜0.05)，表達(dá)PD-

14、1CD4+T細(xì)胞(P＜0.05)、表達(dá)PD-1CD8+T細(xì)胞(P＜0.01)，表達(dá)TLR2(P＜0.05)、TLR3(P＜0.001)、TLR4(P＜0.05)CD14+單核細(xì)胞比率均顯著高于對(duì)照組;IFNα-2b/RBV或PegIFNα-2a/RBV治療12周時(shí)，Treg細(xì)胞和表達(dá)PD-1CD8+T細(xì)胞比率較基線顯著降低(P＜0.05)，治療24周時(shí)表達(dá)PD-1CD8+T細(xì)胞的比率較12周進(jìn)一步下降(P＜0.05)，治療48周時(shí)，表達(dá)

15、PD-1CD4+T細(xì)胞比率較前顯著下降(P＜0.01);IFNα-2b/RBV或PegIFNα-2a/RBV治療12周時(shí)表達(dá)TLR2、TLR3、TLR4CD14+單核細(xì)胞比率較基線顯著升高(P＜0.05)，治療24、48周后降至基線水平。73.5％(25/34)的IFNα-2b/RBV治療患者獲得了cEVR;78.1％(25/32)的PegIFNα-2a/RBV治療患者獲得了cEVR。多因素分析結(jié)果顯示，基線時(shí)較低水平的表達(dá)TLR3CD

16、14+單核細(xì)胞比率為獲得cEVR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(OR=2.11，95％CI:1.15-3.88，P＜0.05)。獲得cEVR的CHC患者較未獲得cEVR者在抗病毒治療前表現(xiàn)為更低水平的表達(dá)TLR3CD14+單核細(xì)胞(P＜0.05)和表達(dá)TLR4CD14+單核細(xì)胞比率(P＜0.05)，在治療12周時(shí)較未獲得cEVR者表現(xiàn)為更低水平的Treg細(xì)胞（P＜0.01）、表達(dá)PD-1CD4+T細(xì)胞(P＜0.01)和表達(dá)PD-1CD8+T細(xì)胞比率(P

17、＜0.05)。
　　 結(jié)論:基線時(shí)外周血低水平的表達(dá)TLR3CD14+單核細(xì)胞比率為CHC患者抗病毒治療獲得cEVR的預(yù)測(cè)因素;干擾素聯(lián)合利巴韋林治療可通過下調(diào)外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞、表達(dá)PD-1CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞比率和上調(diào)表達(dá)TLR2、TLR3、TLR4CD14+單核細(xì)胞的比率協(xié)同抗病毒作用，使患者獲得早期病毒學(xué)應(yīng)答，為治療CHC提供新的免疫靶點(diǎn)。
　　 第三部分：Tim-3/Ga

18、l-9通路在慢性丙型肝炎病毒感染中免疫調(diào)節(jié)作用的研究
　　 目的:探明Tim-3/Gal-9通路在慢性HCV感染中的作用及其調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能的機(jī)制。
　　 方法:選擇18～65歲CHC患者40例，并選擇性別、年齡匹配的健康體檢者20例作為對(duì)照組，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測(cè)對(duì)照組和CHC患者治療前、治療第12、24、48周及治療結(jié)束后隨訪2

19、4周血漿Gal-9、白細(xì)胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)水平。選擇CHC患者和健康對(duì)照各15例，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)進(jìn)行體外培養(yǎng)，給予Tim-3阻斷劑聯(lián)合TLR4激動(dòng)劑脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)或TLR3激動(dòng)劑聚肌胞苷酸[Polyinosinic∶polycytidylicacid,Poly(I∶C)]干

20、預(yù)。所分離PBMC分為5組:空白組（Control）:不予任何干預(yù);TLR4激動(dòng)劑組(LPS):加入LPS培養(yǎng);Tim-3阻斷劑+TLR4激動(dòng)劑組(Anti-Tim-3+LPS):先加入Anti-Tim-3抗體培養(yǎng)30min后再加入LPS培養(yǎng);TLR3激動(dòng)劑組[Poly(I∶C)]:加入Poly(I∶C)培養(yǎng);Tim-3阻斷劑+TLR3激動(dòng)劑組[Anti-Tim-3+Poly(I∶C)]:加入Anti-Tim-3抗體培養(yǎng)30min后加入

21、Poly(I∶C)培養(yǎng)。細(xì)胞共培養(yǎng)24h，分離細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測(cè)IL-12、IFN-α和腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-alpha，TNF-α)表達(dá)水平;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞2'-5'寡腺苷酸合成酶(2'-5'oligoadenylatesynthetase，2'-5'OAS)、粘病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A，MxA)和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑

22、制蛋白1(suppressor of cytokine 1，SOCS1)mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:CHC患者血漿Gal-9水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，抗病毒治療第12、24、48周Gal-9含量均較基線水平顯著降低(P＜0.05)，治療后隨訪24周時(shí)與基線水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，治療過程中不同時(shí)間點(diǎn)Gal-9血漿水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);獲得cEVR與未獲得cEVR、獲得SVR與未獲得SV

23、R患者Gal-9水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CHC患者基線IL-12血漿水平與對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05)，治療12周時(shí)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)和基線水平(P＜0.01)，治療24、48周及治療結(jié)束后隨訪24周時(shí)與基線水平比較無顯著差異(P＞0.05);獲得cEVR與未獲得cEVR、獲得SVR與未獲得SVR患者相比，IL-12水平均無顯著差異(P＞0.05)。健康對(duì)照與CHC患者各組PBMC培養(yǎng)上清中IL-12含量

24、均較低，組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。健康對(duì)照與CHC患者培養(yǎng)細(xì)胞抗病毒因子IFN-α、2'-5'OAS及MxA表達(dá)均為干預(yù)組顯著高于空白組(P＜0.05);除Anti-Tim-3+Poly(I∶C)組外，炎癥因子TNF-α及免疫抑制因子SOCS1表達(dá)均為干預(yù)組顯著高于空白組(P＜0.05)。Anti-Tim-3+LPS組2，-5'OAS和MxAmRNA表達(dá)較單用LPS干預(yù)組顯著升高(P＜0.05)，SOCS1mRNA表達(dá)

25、則較單用LPS干預(yù)組顯著降低(P＜0.05)。Anti-Tim-3+Poly(I∶C)組IFN-α、2'-5'OAS和MxA表達(dá)均顯著高于單用Poly(I∶C)組和Anti-Tim-3+LPS組(P＜0.05)，SOCS1mRNA表達(dá)則顯著低于單用Poly(I∶C)組（P＜0.001），TNF-α在Anti-Tim-3+Poly(I∶C)組含量最低，但與其他干預(yù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CHC患者與健康對(duì)照相比，Anti-

26、Tim-3+LPS組IFN-α和2'-5'OAS表達(dá)、Anti-Tim-3+Poly(I∶C)組2'-5'OAS表達(dá)均顯著低于健康對(duì)照(P＜0.05)，MxA和TNF-α在各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SOCS1除在Anti-Tim-3+Poly(I∶C)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余組均顯著高于健康對(duì)照(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、慢性HCV感染患者血漿Gal-9水平顯著升高，抗病毒治療早期可提高IL-12表達(dá)