新型肝炎病毒感染體系構(gòu)建及抗病毒先天免疫應(yīng)答研究.pdf

1、全球有超過(guò)5億人口屬于丙型肝炎病毒（HCV）和/或乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染人群，這些感染者有可能逐步發(fā)展為慢性肝炎、肝硬化和肝癌。因缺少理想的病毒感染體系而制約了病毒生活周期、先天免疫反應(yīng)以及發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究，從而阻礙了研發(fā)抗病毒藥物的進(jìn)程。盡管乙肝病毒的預(yù)防性疫苗早已上市，HCV疫苗卻還未研發(fā)成功。相比于其它大部分的病毒感染，HCV感染的主要特征是極易形成慢性感染（約80％）。另一方面，約有20%的HCV感染者能夠自動(dòng)清除體內(nèi)

2、病毒而不需要接受治療，表明宿主的先天免疫反應(yīng)可以控制病毒感染。
　　在病毒感染過(guò)程中，誘導(dǎo) I型干擾素和干擾素刺激基因（ISGs）是宿主抵御病毒的主要方式。宿主通過(guò)模式識(shí)別受體（PRRs）捕獲病毒感染所形成的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），激活先天免疫應(yīng)答系統(tǒng)。主要的PRRs包括RIG-I樣受體（RLRs）、Toll樣受體（TLRs）、Nod樣受體（NLRs）和蛋白激酶R（PKR）。然而，HCV和肝細(xì)胞抗病毒先天免疫反應(yīng)之間的復(fù)

3、雜相互作用機(jī)制未知。本研究工作旨在研發(fā)一個(gè)理想的HCV和HBV感染細(xì)胞培養(yǎng)體系，并基于此體系探究宿主應(yīng)答病毒感染的先天免疫機(jī)制。
　　第一，成功分離了一株新型肝癌細(xì)胞系 HLCZ01。該細(xì)胞系來(lái)源于一位患有高分化肝癌的男性病人的肝組織。HLCZ01細(xì)胞的形態(tài)酷似人正常原代肝細(xì)胞（PHH），并表達(dá)多種肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物，包括白蛋白（ALB）、α1-抗胰蛋白酶（AAT）、肝細(xì)胞核因子4（HNF4）、細(xì)胞色素 CYP3A4和miR-12

4、2。同時(shí)，HLCZ01細(xì)胞還表達(dá)HCV的四種受體，分別為CD81、SR-BI、CLDN1和OCLN。
　　第二，HLCZ01細(xì)胞系支持HCV和HBV感染的完整生活周期。HLCZ01細(xì)胞既支持實(shí)驗(yàn)室來(lái)源和臨床病人血清中的HCV感染和復(fù)制，又支持體外來(lái)源的和體內(nèi)病人血清來(lái)源的HBV感染和復(fù)制。從病毒感染的HLCZ01細(xì)胞中組裝和釋放的HBV和HCV可以再感染原始的HLCZ01細(xì)胞。 HLCZ01細(xì)胞支持HBV和HCV共感染，并且這兩種

5、肝炎病毒在HLCZ01細(xì)胞中的復(fù)制互不干擾。抗HBsAg和抗CD81特異性抗體可分別阻斷HBV和HCV入侵 HLCZ01細(xì)胞。已開(kāi)發(fā)的抗病毒藥物可有效抑制HBV和HCV在HLCZ01細(xì)胞中的復(fù)制。HLCZ01是世界首例支持HBV和HCV病人血清直接感染以及 HBV/HCV共感染的肝癌細(xì)胞系，這株細(xì)胞系可應(yīng)用于肝炎病毒生活周期、肝細(xì)胞與肝炎病毒相互作用的研究以及抗病毒藥物和疫苗的研發(fā)。
　　第三，HLCZ01細(xì)胞和PHH具有完整的先

6、天免疫應(yīng)答系統(tǒng)。一方面，HCV感染肝細(xì)胞后可誘導(dǎo) IFN-β和G1P3、ISG12a以及1-8U等抗病毒 ISGs的表達(dá)。在HLCZ01細(xì)胞中，HBV的存在并不影響 HCV誘導(dǎo) IFN-β和ISGs的產(chǎn)生。另一方面，HCV感染 HLCZ01細(xì)胞和PHH至相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，可誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞凋亡，這可能是宿主細(xì)胞清除病毒的另一種先天免疫應(yīng)答方式。在肝細(xì)胞中沉默TRAIL可抑制HCV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。RIG-I缺失可下調(diào)IFN-β和TRAIL

7、的表達(dá)，并阻斷病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)病毒復(fù)制。IRF3是RIG-I的下游信號(hào)分子，同樣參與了TRAIL介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。
　　第四，miR-942通過(guò)調(diào)控 ISG12a表達(dá)以介導(dǎo) HCV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。借助于HLCZ01細(xì)胞感染體系，找到了介導(dǎo) HCV所致細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控分子 ISG12a及其參與HCV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路。經(jīng)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示，miR-942是ISG12a的負(fù)調(diào)控因子。HCV感染可下調(diào)mi

8、R-942的表達(dá)，并且miR-942與 ISG12a在 HCV感染的肝細(xì)胞和肝組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。過(guò)表達(dá)或沉默miR-942可分別減弱或增強(qiáng)HCV誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡。同時(shí)，促凋亡蛋白Noxa在HCV感染細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)的Noxa可介導(dǎo)ISG12a依賴的肝細(xì)胞凋亡。
　　綜上所述，本研究工作構(gòu)建了一株支持 HCV和HBV完整生活周期的新型肝癌細(xì)胞系HLCZ01。借助于該感染體系，初步揭示了若干宿主應(yīng)答病毒感染的先天免疫反應(yīng)節(jié)點(diǎn)