乙肝病毒體內(nèi)外感染模型的建立及其在乙肝新藥藥效學(xué)評價中的應(yīng)用.pdf

1、乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV),是目前已知的感染人類最小的雙鏈DNA病毒,屬于嗜肝DNA病毒科(hepadnavividae)。乙肝病毒感染肝細(xì)胞后,能引起一系列的疾病,如急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等,還往往伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥,然而在過去的三十年由于缺乏理想合適的經(jīng)濟(jì)型HBV感染模型,對HBV的感染機(jī)制和發(fā)病機(jī)制,特別是早期感染機(jī)制不清楚。
　　 乙肝病毒有嚴(yán)格的宿主特異性,除了黑猩猩以外缺乏理想的易

2、感動物模型。雖然黑猩猩能被乙肝病毒感染,而且跟人有親源關(guān)系,具有類似人的乙肝病毒感染史,但是屬于瀕危動物,來源困難、價格昂貴,存在倫理等問題,所以應(yīng)用受到限制,不能作為常規(guī)實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行研究。因此需要來源廣泛且經(jīng)濟(jì)適用的小型動物代替黑猩猩作為HBV感染模型。
　　 雖然目前已經(jīng)有一系列經(jīng)濟(jì)型的小鼠模型在使用,如HBV轉(zhuǎn)基因小鼠、HBV轉(zhuǎn)染小鼠模型、免疫缺陷嵌合肝小鼠模型,但都存在各自的缺點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因小鼠模型存在遺傳不穩(wěn)定、對HBV免

3、疫耐受、病毒復(fù)制過程缺少cccDNA,不適合用于HBV體內(nèi)復(fù)制機(jī)制和病毒清除機(jī)制的研究。HBV轉(zhuǎn)染小鼠模型,因?yàn)榉置诘腍BV病毒不能感染健康的小鼠肝細(xì)胞,不適合作為HBV感染機(jī)制、發(fā)病機(jī)制的模型進(jìn)行研究,作為抗病毒藥物藥效的評價模型也不是很理想,因?yàn)椴《竞芸炀捅磺宄?。嵌合肝免疫缺陷小鼠模?嵌合了人肝細(xì)胞,因此可以作為研究HBV感染機(jī)制、抗病毒藥物藥效學(xué)評價的模型,但是人肝細(xì)胞來源困難,雖然可以用樹鼩肝細(xì)胞代替,但是這樣還不如直接使用樹

4、鼩模型。
　　 早在90年代瑞士和德國科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)樹鼩對HBv具有易感性,他們進(jìn)行了體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)獲得證實(shí)。他們在樹鼩原代肝細(xì)胞體外感染HBV實(shí)驗(yàn)中,肝細(xì)胞內(nèi)能檢測到HBV DNA、HBV RNA,且細(xì)胞上清中有HBsAg和HBeAg的分泌,表明樹鼩肝細(xì)胞能被HBV感染,而且病毒能在樹鼩肝細(xì)胞進(jìn)行繁殖,樹鼩肝細(xì)胞對HBV的易感性后來也被大量的實(shí)驗(yàn)證明。樹鼩在體內(nèi)感染HBV實(shí)驗(yàn)中,他們發(fā)現(xiàn)樹鼩肝組織中有HBV DNA的表達(dá),并且血液中

5、出現(xiàn)了HBsAg,接著產(chǎn)生了HBsAb、HBeAb、HBcAb,病毒很快就被清除,表明樹鼩體內(nèi)能感染HBV,并且屬于一種急性自限性感染。
　　 既然證實(shí)樹鼩體內(nèi)外均能被HBV有效感染,具有完整的病毒感染和復(fù)制過程,而且感染后能引起機(jī)體免疫系統(tǒng)應(yīng)答并被被機(jī)體清除,甚至可能引起肝組織病理變化,這些表明樹鼩不僅可用于研究HBV感染機(jī)制和機(jī)體免疫清除病毒機(jī)制,而且可作為抗HBV新藥藥效學(xué)評價的模型,大量的體外研究證實(shí)了樹鼩肝細(xì)胞的這種應(yīng)

6、用價值。但是,一直以來沒有科學(xué)家在樹鼩體內(nèi)進(jìn)行抗HBV藥物藥效學(xué)的評價研究工作,一方面是由于樹鼩沒有穩(wěn)定的品系,不像其它動物品系那樣具有很好的重復(fù)性,另一方面,沒有人進(jìn)行樹鼩感染HBV后詳細(xì)的病程研究,對樹鼩感染HBV后體內(nèi)病毒繁殖情況以及是否引起樹鼩病理變化不清楚。
　　 不過這給我們一個提示,如果對樹鼩感染HBV后的詳細(xì)病程進(jìn)行深入研究,以樹鼩在體模型作為抗乙肝病毒新藥藥效學(xué)評價模型將更有說服力。基于此,我們做了大量的樹鼩在

7、體感染HBV實(shí)驗(yàn),研究感染后的病理過程。首先摸索樹鼩的有效HBV感染劑量,再確定采血時間點(diǎn),通過對血液化驗(yàn)分析、肝組織免疫組化和病理分析,深入研究樹鼩感染HBV后詳細(xì)的病理過程,并建立病程圖。本次實(shí)驗(yàn)不僅有助于深入研究樹鼩感染HBV后的發(fā)病機(jī)制,而且能給新藥藥效學(xué)的評價體系提供參考數(shù)據(jù),具有重要的醫(yī)學(xué)研究意義。
　　 目前臨床對乙肝的治療策略僅限于對HBV在病人體內(nèi)的復(fù)制進(jìn)行干預(yù),主要通過干擾素和核苷類藥物應(yīng)用。雖然這些藥能暫時

8、能有效控制住病毒的復(fù)制,但是不能完全清除病毒,一旦停藥,仍會復(fù)發(fā)。而且干擾素存在著副作用、穩(wěn)定性差、半衰期短等特點(diǎn),核苷類藥物則容易引起乙肝病毒突變株和耐藥株,雖然通過聯(lián)合用藥可以提高療效,且降低乙肝病毒突變株和耐藥株的產(chǎn)生幾率,但是這種抑制病毒復(fù)制的治療方案不能從根本上治愈乙肝。
　　 近年來通過HepRG細(xì)胞系和樹鼩原代肝細(xì)胞模型的研究發(fā)現(xiàn)乙肝病毒表面抗原preS1蛋白可能與HBV結(jié)合宿主肝細(xì)胞有關(guān),肝細(xì)胞的HBV受體的結(jié)合

9、位點(diǎn)可能就位于preS1上,而且大量體外的研究證實(shí)了preS1 N端的48AA,可能就是HBV結(jié)合肝細(xì)胞步驟中的關(guān)鍵位點(diǎn),而且來源于preS1 N端的48AA的衍生肽經(jīng)豆蔻酰修飾后具有很強(qiáng)的阻斷病毒感染肝細(xì)胞的效果,IC50約為8nM。但是目前這種衍生肽的藥效學(xué)評價僅限于體外研究,沒有在動物體內(nèi)進(jìn)一步評價。這提示我們,如果在動物,如樹鼩體內(nèi)進(jìn)一步評價這種衍生肽的藥效,更能體現(xiàn)出阻斷乙肝病毒感染的藥效。
　　 綜上所述,我們決定建

10、立樹鼩體內(nèi)外感染乙肝病毒模型并應(yīng)用于乙肝病毒表面抗原preS1衍生肽L47的藥效評價。我們首先在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)L47阻斷HBV感染藥效,然后在樹鼩體內(nèi)進(jìn)一步進(jìn)行抗乙肝病毒藥效學(xué)評價。
　　 第一部分實(shí)驗(yàn),我們建立樹鼩體內(nèi)外感染乙肝病毒模型,并進(jìn)行鑒定。首先建立樹鼩肝細(xì)胞體外感染乙肝病毒模型,通過不連續(xù)蔗糖梯度離心獲得的乙肝病病毒用于體外感染實(shí)驗(yàn),兩步灌注法分離樹鼩肝細(xì)胞,進(jìn)行原代培養(yǎng)作為病毒感染對象,用不同感染復(fù)數(shù)的乙肝病毒進(jìn)行

11、孵育感染,發(fā)現(xiàn)乙肝病毒能有效感染樹鼩肝細(xì)胞,并在肝細(xì)胞內(nèi)的繁殖,病毒表達(dá)量與感染復(fù)數(shù)成良好的依賴關(guān)系,表明我們成功建立了HBV體外感染模型;然后我們建立樹鼩體內(nèi)感染乙肝病毒模型,通過摸索有效HBV感染劑量和采血時間點(diǎn),并對采集到的血液標(biāo)本進(jìn)行病毒血清學(xué)定量檢測、ALT生化定量測定、HBV DNA熒光定量PCR檢測,我們不但證實(shí)了HBV感染樹鼩后能在肝組織內(nèi)大量繁殖,而且發(fā)現(xiàn)HBV引起樹鼩急性肝炎。
　　 第二部分實(shí)驗(yàn),在建立好的