新型小鼠乙肝病毒受體模型的建立及其初步研究.pdf

1、人類乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)屬于DNA病毒。HBV能引起人類急、慢性肝炎和肝細胞癌。與其他病毒性疾病一樣，HBV的感染可能是由病毒外膜上的蛋白與宿主細胞膜上的一個或多個受體結合而引發(fā)。HBV只能感染人類和某些靈長類細胞，而缺乏在體外細胞系細胞內的繁殖和傳播能力。HBV的復制及細胞損傷主要限于肝臟，肝細胞是HBV的主要宿主細胞，而HBV在肝外存在及復制的意義尚不清楚。 本課題的目的就是要建立一種新型的

2、理想而又經濟的HBV受體研究的小鼠模型，并初步探討SCCA1在體內HBV感染過程中所起的作用。 研究方法質粒構建：質粒pMC-LacZ和pMC-SCCA1按照陳志英等人文獻中所描述的方法構建CsCl-密度剃度離心純化質粒并保存于-20℃。通過對比260和280nm的吸收度以及2％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度。 半乳糖苷酶測定(X-gal染色)：用X-gal染色的方法可以測定外源基因LacZ在小鼠肝臟表達與否以及表達位置

3、。小鼠尾靜脈高壓注射含MC-LacZ質粒的生理鹽水2ml后24小時處死動物，做10μm肝臟冰凍切片，X-gal溶液染2小時，核固紅復染30秒，陽性細胞的胞質和胞核染成藍色，陰性細胞為粉紅色。 小鼠體內轉染pMC-SCCA1：小鼠尾靜脈高壓注射含質粒pMC-SCCA1的生理鹽水2ml，注射速度保持在0.4ml/s。 小鼠注射人類HBV-DNA陽性血清：24小時后小鼠尾靜脈注射人類HBV-DNA陽性血清0.3ml，再過24小

4、時小鼠腹腔注射HBV-DNA陽性人類血清0.3ml，然后于適當的時間取小鼠血清和肝臟標本檢測。 SCCA1的組織學免疫組化檢測：小鼠分組：動物分為五個實驗組和一個對照組，實驗組小鼠尾靜脈高壓注射含pMC-SCCA1的生理鹽水；對照組小鼠尾靜脈高壓注射不含pMC-SCCA1的生理鹽水。五個實驗組分別于第3、7、17、27、37天處死；對照組于第3天處死。每組兩只Nod-Scic小鼠。 小鼠分別于實驗第3、7、17、27、3

5、7天處死，制作肝臟石蠟切片作SCCA1免疫組化檢查。 小鼠肝臟HBsAg免疫組化檢測：檢測方法同上，一抗為山羊抗-HBsAg.小鼠分組：動物分為5個實驗組和6個對照組，每組兩只Nod-Scid小鼠。所有實驗組小鼠于第-2天尾靜脈高壓注射含pMC-SCCA1的生理鹽水2ml，第-1天尾靜脈注射含HBV-DNA的乙型肝炎患者血清0.3ml，第0天小鼠腹腔注射含HBV-DNA的乙型肝炎患者血清0.3ml，五個實驗組分別于第3、7、17

6、、27、37天處死；對照組1-5的小鼠于第-2天尾靜脈高壓注射不含pMC-SCCA1的生理鹽水2ml，第-1天尾靜脈注射含HBV-DNA的乙型肝炎患者血清0.3ml，第0天小鼠腹腔注射含HBV-DNA的乙型肝炎患者血清0.3ml，五個對照組分別于第3、7、17、27、37天處死。對照組6小鼠于第-2天尾靜脈高壓注射含pMC-SCCA1的生理鹽水2ml，第-1天尾靜脈注射生理鹽水0.3ml，第0天小鼠腹腔注射生理鹽水0.3ml，第3天處死

7、。對照組7為正常小鼠，無任何注射。 小鼠血清HBsAg的ELISA檢測：采用美國雅培公司HBsAg定性檢測試劑盒和配套設備AXSYMsystem檢測，操作按照說明書進行。 小鼠血清和肝臟的HBV-DNA-PCR定性檢測：分別采用不同方法取得小鼠血清和肝臟的DNA溶液，然后用中山大學達安基因檢測中心的HBV-DNA-PCR定性檢測試劑盒以及2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。 結果以LacZ作為報告基因，我們可以很方便快捷地檢

8、測外源基因的表達與否及位置。在小鼠尾靜脈高壓注射含MC-LacZ質粒的生理鹽水2ml后24小時，肝臟冰凍切片X-gal溶液染色顯示外源基因可以在小鼠肝臟內表達，陽性細胞主要聚集在小鼠肝臟中央靜脈周圍。 SCCA1的表達方式和陽性表達的細胞種類可以通過免疫組化的方法測定。小鼠尾靜脈高壓注射含MC-SCCA1質粒的生理鹽水2ml24小時后，做肝臟石蠟切片檢測SCCA1陽性表達細胞。結果顯示有一定數量的肝細胞為陽性反應，這些細胞主要聚

9、集在中央靜脈和肝竇狀隙附近。SCCA1陽性細胞計數結果顯示SCCA1的陽性表達率大約30％，并可持續(xù)至少37天。 小鼠肝臟的HBsAg的免疫組化結果顯示，在不事先注射pMC-SCCA1的小鼠肝臟內，如果直接向小鼠體內輸入乙肝患者HBV-DNA陽性血清(對照組)，在小鼠肝臟內將無法檢測到HBsAg陽性反應；相反地。在事先注射pMC-SCCA1的小鼠肝臟內，再向小鼠體內輸入乙肝患者HBV-DNA陽性血清(實驗組)，在小鼠肝臟內可以見

10、到HBsAg陽性反應細胞，這些細胞主要集中在中央靜脈和肝竇狀隙附近，包括肝細胞、Kupffer氏細胞、肝竇內皮細胞，HBsAg陽性反應長達17天，在實驗第27、37天則未檢測到陽性細胞。 小鼠血清HBsAg定性ELISA檢測顯示，在對照組(第一組，不事先尾靜脈注射pMC-SCCA1而直接向小鼠體內輸入乙肝患者HBV-DNA陽性血清)中，第3天顯示陽性，而在第7、17、27、37天均為陰性；而在實驗組(第二組，事先尾靜脈注射pMC

11、-SCCA1再向小鼠體內輸入乙肝患者HBV-DNA陽性血清)中，第3、7天可檢測到陽性反應，17天后均為陰性。 HBV-DNA-PCR定性檢測結果顯示，在對照組中，第3天時小鼠血清和肝臟都為陽性反應，第7天以后，血清和肝臟中均無法檢測到HBV-DNA；實驗組在第3、7天時，血清和肝臟標本均為陽性，肝臟標本的陽性反應時間更長，到第17天是染為陽性，但27、37天時為陰性反應。 討論肝臟不僅負責合成多種蛋白，同時也涉及大量的

12、遺傳性和獲得性疾病的發(fā)生發(fā)展，所以肝臟也是基因治療研究的重要靶器官。而載體是轉基因的重要工具，目前已經發(fā)現了大量的載體工具，包括重組逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體以及非病毒載體，例如脂質體、陽離子聚合體和再造乳糜微粒。雖然肝臟轉基因研究已經取得很大進展，但每種載體的應用都還存在許多困難和問題。例如，重組逆轉錄病毒載體雖然可以實現外源基因在肝臟的長期表達。但這一結果需要進行肝部分切除或肝損傷來刺激肝細胞的再生和分化；腺病毒載體

13、可以提高轉基因的效率，但由于引起宿主的免疫反應而縮短外源基因的表達時間；腺相關病毒載體可以使外源基因長期表達，但其攜帶外源基因的長度不能超過5.2kb；目前己知的非病毒載體的轉基因效率較低。為了解決在小鼠體內外源基因轉染的困難，Zhang等人探索出一種小鼠尾靜脈高壓注射技術，使外源基因到達并轉染小鼠肝細胞，他們的實驗證明在進行這種操作后，小鼠肝臟是體內唯一表達外源基因的器官，陽性反應長達6個月以上。在本課題中，我們利用小鼠尾靜脈高壓注射

14、技術成功地將HBV結合蛋白基因SCCA1轉染至HBV的宿主器官——肝臟。 在人類疾病的基因治療中，由于普通載體會造成外源基因表達逐漸下降，在一定程度上限制了非病毒載體的應用。陳志英等人最先證實了，在載體中與哺乳類動物表達盒(mammalianexpressioncassette)相連的細菌DNA序列導致了體內外源基因的反轉錄沉默。對此，他們發(fā)明了一種)噬菌體φC31整合酶介導的分子內再結合技術，去除造成基因沉默的細菌序列，由此而

15、得到小環(huán)DNA載體(minicirleDNAvector)，實驗證明，小環(huán)DNA載體使報告基因humanfactorⅨandα1-antitrypsin的表達量分別提高了45倍和560倍。小環(huán)DNA載體可以為疾病的基因治療提供有效的工具。在本課題中，我們以小環(huán)DNA載體為工具，實現了HBV結合蛋白基因SCCA1的穩(wěn)定表達，這種轉基因小鼠將為HBV受體研究提供非常有用的動物模型。 在此小鼠模型上，我們對HBV結合蛋白基因SCCA1

16、的受體功能進行了初步研究。各項檢測結果，不論是免疫組化染色、ELISA或者HBV-DNA-PCR檢測，都顯示了在小鼠尾靜脈高壓注射了pMC-SCCA1后，HBV在小鼠體內滯留時間明顯延長。這一發(fā)現提示pMC-SCCA1的表達產物-HBV結合蛋白有助于HBV與宿主細胞膜的黏附，另外也提示，在介導病毒內吞的過程中，HBV結合蛋白可能是作為聯(lián)合受體而起重要作用。但其在HBV感染過程中所起的具體作用仍需進一步的研究來證實。 除此之外，我

17、們的研究還發(fā)現，肝竇內皮細胞和Kupffer氏細胞在免疫組化染色中呈現較強的陽性反應。這一發(fā)現提示這些細胞可能對于HBV病毒的清除具有重要的作用，這些細胞是抵御HBV病毒感染的前沿防線，它們如果出現免疫功能障礙可能會提高HBV感染肝細胞的機會。 本課題的研究結果顯示，通過小鼠尾靜脈高壓注射小環(huán)DNA載體的方法，可以實現外源基因，疑似HBV受體基因在小鼠肝臟內的長期穩(wěn)定的表達，這種小鼠將為HBV受體基因研究提供合適而又經濟的動物模