乙肝病毒檢測(cè)的方法學(xué)評(píng)價(jià)

1、乙肝病毒檢測(cè),——方法學(xué)評(píng)價(jià),乙肝病毒結(jié)構(gòu),（一） 乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)特點(diǎn),HBsAg：是HBV感染的主要標(biāo)志HBsAb：保護(hù)性抗體HBcAg：僅存于感染的肝細(xì)胞核內(nèi)，　　　　一般不存在于血循環(huán)中HBcAb: 非保護(hù)性抗體，HBcAb-IgM　　　　提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)HBeAg：HBV復(fù)制及強(qiáng)感染性的指標(biāo)HBeAb：有一定的保護(hù)作用，預(yù)后良好,患者血清中存在三種基本形態(tài),大球型顆粒，又稱(chēng)Dane顆粒；小球型顆粒；

2、管型顆粒小球型顆粒；管型顆粒管型顆粒,乙型肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷,（一）血清學(xué)檢查 （二）生化學(xué)檢查 （三）HBV DNA、基因型和變異檢查,血清學(xué)檢查,項(xiàng)目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBc IgM方法ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，最常用，定性),,HBsAg – 感染的標(biāo)志Anti-HBs – 既往感染/接種疫苗An

3、ti-HBc IgM – 急性感染標(biāo)志Anti-HBc IgG – 既往或慢性感染HBeAg – 急性病毒復(fù)制，有傳染性 Anti-HBe –病毒不再?gòu)?fù)制HBV-DNA – 急性病毒復(fù)制，比HBeAg更準(zhǔn)確；主要用于監(jiān)測(cè)治療反應(yīng),HBV血清學(xué)標(biāo)志物的臨床意義,兩對(duì)半的意義,— 乙型肝炎的診斷— 判斷傳染性— 判斷預(yù)后— 篩查獻(xiàn)血員— 流行病學(xué)調(diào)查,,乙肝三系定性檢查是用來(lái)判斷是否感染乙肝或粗略估計(jì)病毒復(fù)制水

4、平的初步檢查，對(duì)患者病情程度的評(píng)估參考性不大，所以乙肝患者在做乙肝三系定性檢查的時(shí)候，應(yīng)結(jié)合肝功能檢查、乙肝病毒DNA檢查、B超檢查等來(lái)判定病情的輕重，,ELISA檢測(cè)靈敏低的原因及局限,ELISA法受其自身敏感性和特異性的限制;HBV S和前C基因區(qū)出現(xiàn)位點(diǎn)突變導(dǎo)致HBsAg和HBeAg表達(dá)缺陷。影響因素多,如加樣時(shí)間,試劑平衡時(shí)間,樣本溶血程度等等。特別是低濃度樣本易導(dǎo)致假陰性結(jié)果,使弱陽(yáng)性樣本漏檢。急性感染的窗口期; HBs

5、Ag檢測(cè)方法靈敏度不足;血清亞型的漏檢等。標(biāo)本中病毒顆粒少;,血清學(xué)檢測(cè)的局限性,HBV具有“檢測(cè)窗口期假陰性結(jié)果無(wú)法檢測(cè)突變株及抗體,乙肝病毒的定量檢測(cè),1、乙肝表面抗原（HBsAg）定量檢測(cè)：1）參考值：0-0.05IU/mL2）臨床意義：（1）可作為HBV攜帶者乙肝病毒復(fù)制的參考指標(biāo)（2）評(píng)價(jià)拉美呋定的治療效果（3）監(jiān)測(cè)應(yīng)用alpha-干擾素治療病人的乙肝病毒復(fù)制（4）確定肝移植病人免疫球蛋白的使用劑量,2.乙肝

6、表面抗體（抗-HBs）定量測(cè)定：,是HBsAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體，是一種保護(hù)性抗體，能中和HBV。（1）抗-HBs含量在0-10mIU/ml，表示不具有保護(hù)性，需要注射乙肝疫苗（3針：0-1-6方案）。（2）抗-HBs含量在10-100mIU/ml，表示具有保護(hù)性，但較弱，需要乙肝疫苗強(qiáng)化注射（1針）。（3）抗-HBs含量大于100mIU/ml，表示具有很強(qiáng)的保護(hù)性，不需要注射乙肝疫苗。,,3、乙肝病毒e抗原（HBeAg）

7、HBeAg增高說(shuō)明病毒復(fù)制，具有很強(qiáng)的傳染性。4、乙肝病毒e抗體（抗-HBe）抗-HBe陽(yáng)性說(shuō)明病毒復(fù)制減少，傳染性弱，但并非沒(méi)有傳染性?？笻Be不是保護(hù)性抗體 。,,5、乙肝病毒核心抗體（抗-HBc）抗-HBc：不是中和抗體，有IgG和IgM兩種形式。IgM在早期出現(xiàn)，而IgG在恢復(fù)期出現(xiàn)，可持續(xù)多年或終身存在。,乙肝五項(xiàng)定量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn),由于乙肝病毒容易發(fā)生變異，再加上乙肝定性檢測(cè)方法的局限性，會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，導(dǎo)致不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)

8、乙肝的感染，也就不能得到及時(shí)的治療，對(duì)醫(yī)護(hù)人員和其他患者也存在著被感染的威脅。乙肝五項(xiàng)定量應(yīng)用目前最先進(jìn)的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，避免了假陰性和漏檢的問(wèn)題，而且準(zhǔn)確，尤其對(duì)乙肝病人的療效觀(guān)察提供了依據(jù)，這是檢驗(yàn)發(fā)展的趨勢(shì)。,,兩對(duì)半定量檢測(cè)極大地提高了檢測(cè)的靈敏度，LiCa技術(shù)檢測(cè)HBsAg靈敏度可達(dá)0．5ng/ml，而ELISA檢測(cè)HBsAg達(dá)到2ng/ml時(shí)才會(huì)陽(yáng)性。急性乙肝早期定量能及早檢出HBsAg，確證HBV感染，幾乎能與Pre

9、Si同時(shí)檢測(cè)，在病程觀(guān)察中大大縮短了“窗口期”，而酶標(biāo)檢測(cè)在乙肝早期往往HBsAg呈陰性。慢性乙肝一些患者由于機(jī)體常缺乏對(duì)HBV包膜蛋白的免疫應(yīng)答，HBsAg表達(dá)較低，酶標(biāo)檢測(cè)可出現(xiàn)HBsAg和HBsAb均陰性的情況，而定量檢測(cè)則可避免這些情況的出現(xiàn)，為正確判斷病情提供依據(jù)。靈敏度如病毒發(fā)生變異后，表達(dá)量較低，常規(guī)ELISA測(cè)不出抗原，而定量檢測(cè)具有極高的靈敏度，可發(fā)現(xiàn)極有可能同時(shí)檢測(cè)出HBsAg和HBsAb，血清中HBsAg含

10、量與病人對(duì)HBsAg細(xì)胞免疫成反比關(guān)系，而肝功能改變則與此種細(xì)胞免疫成正比。定量HBsAg是反映這一關(guān)系的唯一手段。可發(fā)現(xiàn)低濃度的HBsAg攜帶者，特別是一些群體如醫(yī)務(wù)工作者及病人家屬等。,定量檢測(cè)意義,監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展評(píng)估藥物療效指導(dǎo)疫苗接種,國(guó)內(nèi)疫苗評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),無(wú)應(yīng)答者:無(wú)抗體產(chǎn)生 (5%) ---- 加強(qiáng)計(jì)量復(fù)種低應(yīng)答者:100 IU/L (20%) ---- 無(wú)須復(fù)種,PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用,乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科（

11、hepadnaviridae），基因組長(zhǎng)度3.2kb 目前感染人類(lèi)最小的DNA病毒 部分雙鏈環(huán)狀DNA。,定量PCR的特點(diǎn),可定量結(jié)果，準(zhǔn)確靈敏地反應(yīng)了病原體的感染和治療恢復(fù)情況光譜分析儀直讀結(jié)果，自動(dòng)分析， 增強(qiáng)了靈敏性和客觀(guān)性。,,HBV基 因 及 編 碼 蛋 白,HBV-DNA定量檢測(cè)的臨床應(yīng)用,慢性乙肝診斷治療監(jiān)測(cè)和療效評(píng)價(jià)跟蹤隨訪(fǎng)預(yù)后判斷,（二） HBV-DNA與“兩對(duì)半”,1. “兩對(duì)半

12、” ：機(jī)體的免疫反應(yīng)狀態(tài)；FQ-PCR：檢測(cè)的是HBV本身的遺傳物質(zhì)—DNA，是 病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)。2. “攜帶者”、“大三陽(yáng)”、“小三陽(yáng)”等免疫學(xué)指標(biāo)不能 反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。,,3. 血清學(xué)指標(biāo)(－)不能排除HBV感染。4. 也可能出現(xiàn)HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。5. HBsAb (＋) 、 HBcAb (＋) 、 HBeAb (

13、＋)三抗體陽(yáng)性 與HBV DNA 2.5× 103 copy /ml 結(jié)果解釋。,HBV-DNA檢測(cè)的臨床意義,⒈ 診斷方面： ⑴ HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù) ⑵ HBV DNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志 ⑶ HBV DNA是患者具有傳染性的標(biāo)志⑷ 對(duì)HBV-M起補(bǔ)充作用： ① HBeAg(﹣)/ 抗HBe(﹢)乙型肝炎 （前C區(qū)變異） ② HBsAg(﹣)乙型肝

14、炎 （S區(qū)變異） ③ 低水平感染 單項(xiàng)抗HBc(﹢)乙型肝炎,,⒉ 療效判斷： HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo) ⒊ 預(yù)后判斷 HBV DNA水平與病情有一定的關(guān)系,,一、乙肝病毒DNA檢查可檢查乙肝病毒的復(fù)制狀況。如乙肝病毒DNA測(cè)定值>1000copies/ml，就提示乙肝病毒有復(fù)制，而且病毒數(shù)量的高低與病毒復(fù)制的程度成正相關(guān)。若結(jié)果陰性，則表明病

15、毒處于不活躍階段，病情比較平穩(wěn)?！　《⒁腋尾《綝NA檢查還是判斷乙肝病毒傳染性的重要指標(biāo)。如果乙肝病毒DNA測(cè)定值>1000copies/ml，常提示具有傳染性，且檢測(cè)值越高就說(shuō)明乙肝病毒復(fù)制越活躍，傳染性越強(qiáng)。,,三、乙肝病毒DNA檢查可以作為肝病患者確診病情的主要依據(jù)。乙肝病毒DNA陽(yáng)性者，即使肝功能正常，必要時(shí)也應(yīng)考慮進(jìn)行抗病毒治療。乙肝抗病毒治療的標(biāo)準(zhǔn)就是乙肝病毒DNA>1000copies/ml，且患者轉(zhuǎn)氨酶

16、超過(guò)正常值兩倍，此時(shí)是肝病患者抗病毒治療的最佳時(shí)機(jī)?！　∷摹⒁腋尾《綝NA檢查結(jié)果還可以在一定程度上輔助判斷乙肝病毒是否產(chǎn)生了變異，如在治療過(guò)程中乙肝病毒DNA檢測(cè)結(jié)果由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性時(shí)，則提示病毒已發(fā)生變異，應(yīng)結(jié)合具體病情重新選擇抗病毒藥物。,基因檢測(cè)在乙肝診療各階段的應(yīng)用,,藥物治療方案的確定（用藥：干擾素、拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋）,藥物治療（療效評(píng)價(jià)）,前C區(qū)1896位點(diǎn)突變檢測(cè),跟蹤隨訪(fǎng),,,,乙 肝 病 毒 定 量

17、檢測(cè),確診,病毒學(xué)分析,乙肝病毒分型檢測(cè),拉米夫定耐藥檢測(cè),阿德福韋耐藥檢測(cè),,,,共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)檢測(cè),,恩替卡韋耐藥檢測(cè),,,,,,,FQ-PCR檢測(cè)的優(yōu)勢(shì),靈敏度高可以達(dá)到 pg 級(jí)而 ELISA 只能檢測(cè) ng級(jí)，可以檢測(cè)包括乳汁的其他低含量的標(biāo)本;不受病毒變異影響，而前C和S變異后ELISA難以檢測(cè);熒光定量PCR 技術(shù)采用閉管檢測(cè), 無(wú)須凝膠電泳, 避免了交叉污染,實(shí)現(xiàn)了對(duì)HBV DNA 的定量