乙肝病毒（HBV）基因型多重PCR檢測體系的建立及初步驗證.pdf

1、乙型肝炎(HepatitisB)是由乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)引起的一種嚴重危害人類健康的傳染性疾病，其治療是人類目前面臨的重大難題之一。我國有近1.3億人患有乙型肝炎，是慢性乙型肝炎高發(fā)國。研究已發(fā)現(xiàn)不同基因型的HBV感染患者后，在臨床病程和對治療的反應(yīng)上都存在著一定的差異，HBV基因分型對HBV感染的流行病學(xué)、病因?qū)W以及臨床診治具有重要意義。 本研究根據(jù)Genbank中查出的336種乙肝病毒(包括

2、A-H八種基因型)的全基因組序列，利用DNASIS軟件對全基因區(qū)域以及S基因區(qū)域進行同源性比較，設(shè)計出8對多重PCR反應(yīng)的特異性引物，A-H各型特異擴增片段理論大小依次為353bp、181bp、688bp、140bp、774bp、589bp、224bp和237bp。 利用華美生物工程公司提供的乙肝病毒4℃-PCR檢測試劑盒對826份乙肝疑似患者的血清樣本進行陽性篩選，篩選出657份陽性樣本；并用這8對引物對657份陽性樣本進行單

3、PCR分型，結(jié)果為A基因型1.98％(13/657)，B基因型14.31％(94/657)，C基因型49.77％(327/657)，BC基因混合型4.26％(28/657)，D基因型0.91％(6/657)。將四型(A、B、C、D)特異擴增的基因片段克隆到pGEM-T載體上，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌；對重組質(zhì)粒中的插入片段進行DNA測序，四型特異擴增片斷(353bp、181bp、688bp和140bp)與理論擴增片段大小相同，且與Genban

4、k中已分型的HBV相應(yīng)的堿基序列比對，結(jié)果基本相同。 建立并優(yōu)化了多重PCR分型檢測體系。優(yōu)化結(jié)果為①反應(yīng)體積為30μl，其中20×buffer1.0μl，Mg2+2.8mM，dATP、dCTP、dGTP和dTTP都為270μM，Taq酶2.5U，模板3.5μl，p1：p2=1：1且PA、PC終濃度為8pM，PC、PD終濃度為10pM，BB0.2μl。②循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性300s，然后94℃變性45s、58℃退火45s、7