乙肝病毒基因型和病毒變異與肝細(xì)胞癌的關(guān)系研究.pdf

1、臨床流行病學(xué)和病毒學(xué)研究表明，在我國(guó)，乙型肝炎病毒(HBV)感染是肝細(xì)胞癌(HCC)最重要的病因，HBV復(fù)制在肝炎、肝硬化、肝癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中、甚至肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)階段都可能起重要的作用，然而，HBV致HCC的確切機(jī)制目前還沒(méi)有明確。根據(jù)HBV全基因序列異質(zhì)性≥8％的標(biāo)準(zhǔn)，將HBV分為A-H八個(gè)基因型，研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)主要的基因型是B型與C型，并發(fā)現(xiàn)基因型與病毒變異有一定的依從性，尤其是核心啟動(dòng)子(BCP)變異和前C終止密碼子變異(PC)

2、。最近許多研究表明HBV基因型、病毒變異、HBV DNA水平與HCC存在一定的關(guān)系，然而還沒(méi)有統(tǒng)一的觀點(diǎn)，甚至出現(xiàn)相反的結(jié)論。 為進(jìn)一步研究HBV基因型及病毒變異與HCC發(fā)生的確切關(guān)系，我們利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)以及部分PCR產(chǎn)物測(cè)序的方法對(duì)401例慢性HBV感染者，包括112例HCC患者(HCC組)，129例無(wú)癥狀攜帶者(ASC組)，70例肝硬化患者(LC組)和90例慢性肝炎患者(CH組)

3、進(jìn)行HBV基因分型和C基因亞型鑒定，以及BCP和PC變異檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)401例慢性HBV感染者HBV基因型為B基因型或C基因型感染，未發(fā)現(xiàn)其他基因型，HCC組中C型分布高于其他三個(gè)疾病組；在HCC病例組中血清纖維化指標(biāo)的多因素分析提示前膠原Ⅲ肽(PⅢP)水平在C基因型中高于B基因型。對(duì)基因型與HBV變異和臨床特點(diǎn)作了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)C基因型患者BCP變異多于B基因型；B基因型患者PC變異多于C基因型；同時(shí)BCP變異發(fā)生率隨著病程進(jìn)展而遞

4、增：在HCC組、LC組、CH組和ASC組里的BCP變異陽(yáng)性率分別為74.1％，50.0％，35.0％，22.4％。對(duì)270例患者(HCC 112例，LC 70例，CH 90例)進(jìn)行HBV亞型鑒定，發(fā)現(xiàn)C1有105例(67.7％)，C2有50例(32.3％)，顯示C1在本研究對(duì)象中的分布高于C2；對(duì)亞型與HBV BCP、PC變異的比較，發(fā)現(xiàn)C1亞型帶有較高的BCP變異。 因此本章研究結(jié)果提示HBV C基因型和BCP變異是HCC發(fā)生

5、的密切相關(guān)因素。近年來(lái)，雖然肝癌治療措施尤其是肝葉切除術(shù)已有很大的改進(jìn)和提高，但肝癌的長(zhǎng)期預(yù)后仍不佳，其重要的原因是腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移率高。據(jù)有關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，5年左右肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)超過(guò)70％，目前對(duì)引起肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的多種臨床危險(xiǎn)因素已有一些研究，包括腫瘤本身的相關(guān)因素和肝臟功能情況。包括腫瘤大小、是否存在包膜、瘤體本身的血管侵潤(rùn)情況，肝臟功能以及肝葉切除的方式等都會(huì)影響肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。然而越來(lái)越多的證據(jù)提示HBV基因型與HCC的發(fā)生

6、發(fā)展有密切關(guān)系并影響著HBV相關(guān)性肝病的臨床表現(xiàn)和臨床結(jié)局，在HBV的8個(gè)基因型中，東南亞地區(qū)主要以B型和C型為主，最近的研究資料以及前面的研究已經(jīng)證實(shí)C基因型較B基因型有較高的HCC發(fā)生率和引起更為嚴(yán)重的肝細(xì)胞損害，是促進(jìn)HCC發(fā)生的高危因素，然而，HBV基因型與病毒載量對(duì)肝細(xì)胞癌的預(yù)后影響尚未得到深入研究，因此我們繼續(xù)對(duì)前一部分研究對(duì)象中112例HCC患者進(jìn)行追蹤觀察，探討HCC治療后腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。在明確HBV基因型、病

7、毒變異的基礎(chǔ)上，采用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行HlBV DNA定量測(cè)定，結(jié)果顯示最終進(jìn)入隨訪研究的106例HCC患者(在隨訪過(guò)程中6例患者由于以下原因而列出研究范圍：4例患者在隨訪52周后觀察資料缺失；2例沒(méi)有完整的病理資料，因此共106例患者進(jìn)入最終的前瞻性研究)有69例在手術(shù)后或肝動(dòng)脈栓塞化療術(shù)(TACE)治療后兩年內(nèi)出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，其發(fā)生率隨著時(shí)間的推移而逐漸上升，在20周、40周、60周、80周、100周和130周分別為3

8、.8％，9.4％，18.9％，42.5％，59.4％和65.1％。對(duì)基線資料的單因素分析，發(fā)現(xiàn)血清高水平GGT、無(wú)包膜瘤體、門靜脈栓塞形成、較大肝癌、肝硬化、BCP變異、C基因型、HBV DNA水平均與肝細(xì)胞癌的高復(fù)發(fā)率或轉(zhuǎn)移率有關(guān)，而年齡、性別、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平、血小板計(jì)數(shù)、血清白蛋白水平、甲胎蛋白、總膽紅素、Child-Pugh分?jǐn)?shù)和治療手段與肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。 多因素分析顯示HBV C基因型和HBV DNA高水平是H

9、BV相關(guān)性HCC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移率隨著HBV DNA水平的上升而增加，在基線HBV DNA水平小于3 loglo拷貝/mL的肝細(xì)胞癌患者中，腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移率為22％，在基線HBV DNA水平大于5 loglo拷貝/ml的肝細(xì)胞癌患者中，腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移率升為80％；在106例HCC患者中B基因型29例，C基因型77例；其中77例C基因型有57例(74.0％)發(fā)生腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，29例B基因型有12例(41.4％)發(fā)生

10、腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，通過(guò)Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)基因型C較B基因型有更高的肝癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移發(fā)生率。因此，HBV C基因型和HBV DNA高水平是HBV相關(guān)性HCC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，同時(shí)對(duì)HBV C基因型與HBV DNA的相關(guān)性分析顯示這兩個(gè)危險(xiǎn)因素之間沒(méi)有關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步表明HBV C基因型和HBV DNA水平分別是HCC復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的相互獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。提示HBV C基因型不僅與HCC的發(fā)生有密切關(guān)系，同時(shí)也影響著腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因

11、此臨床上需要對(duì)慢性HBV感染者進(jìn)行HBV基因型鑒定，以更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)慢性HBV感染的臨床結(jié)局和評(píng)估HCC患者的預(yù)后。血清高水平HBV DNA是HBV相關(guān)性HCC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示抗病毒治療不僅應(yīng)用于慢性肝炎患者，對(duì)HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌術(shù)后進(jìn)行抗病毒治療也是非常必要的。在前面兩部分的研究中，我們通過(guò)401例慢性HBV感染者(包括肝細(xì)胞癌患者、肝硬化患者、慢性肝炎患者、無(wú)癥狀攜帶者)分析了HBV基因型、亞型、病毒變異的情況，發(fā)現(xiàn)了

12、HBV C基因型和BCP變異與肝細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展有密切關(guān)系，C基因型和HBV DNA水平可影響HCC的預(yù)后和腫瘤轉(zhuǎn)歸，是肝細(xì)胞癌變的重要危險(xiǎn)因素。由于HBx基因序列覆蓋了BCP區(qū)域，BCP區(qū)的T1762/A1764核苷酸雙突變導(dǎo)致X蛋白的第130和131位氨基酸發(fā)生改變，同時(shí)HBx可通過(guò)與細(xì)胞因子或蛋白結(jié)合而發(fā)揮其肝癌變作用，因此，探討HBx基因?qū)?xì)胞周期蛋白的調(diào)控機(jī)理為揭示HBV致肝細(xì)胞癌變機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 我們通過(guò)

13、構(gòu)建HBV-X基因BCP陽(yáng)性真核表達(dá)載體(HBV-X-BCP<'+>)和HBV-X基因BCP陰性真核表達(dá)載體(HBV-X-BCP<'->)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，Western Blotting鑒定HBx融合蛋白和p21<'WAFI/CIPI>蛋白的表達(dá)，觀察BCP變異引起的X蛋白兩個(gè)氨基酸的變化是否會(huì)影響細(xì)胞周期蛋白p21<'WAFI/CIPI>的表達(dá)情況，從而明確BCP變異致HCC的發(fā)生機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BCP變異陰性的野生型HB

14、x基因能促進(jìn)p21<'WAFI/CIPI>蛋白的表達(dá)，而B(niǎo)CP陽(yáng)性的變異型HBx基因卻下調(diào)p21<'WAFI/CIPI>蛋白的表達(dá)，提示HBVX基因致肝細(xì)胞癌變的重要機(jī)制是由于長(zhǎng)期的病毒感染導(dǎo)致HBV BCP變異，使HBx基因的兩個(gè)氨基酸發(fā)生變化，致使細(xì)胞周期蛋白p21<'WAFI/CIPI>表達(dá)下降，異常細(xì)胞迅速增生，受損細(xì)胞順利通過(guò)G0-G1期進(jìn)入DNA合成分裂階段，細(xì)胞對(duì)癌基因敏感性增強(qiáng)，異常細(xì)胞在無(wú)控制的情況下增長(zhǎng)，極易出現(xiàn)幼稚