肝細(xì)胞癌中的乙肝病毒基因整合規(guī)律及其促癌作用研究.pdf

1、研究背景:
　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染導(dǎo)致的肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是中國(guó)最重要的死亡原因之一。體細(xì)胞變異是HCC進(jìn)化的基礎(chǔ)，而HBV基因整合是HBV-HCC特有的突變類型，也是HBV直接損傷人體基因組的方式。大量研究發(fā)現(xiàn)HBV整合事件在HCC基因組中積累，提示這類突變可以賦予變異細(xì)胞生存優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而促進(jìn)癌癥發(fā)生。目前該領(lǐng)域的研究存在以下局限性:

2、首先，關(guān)于HBV整合的研究都局限在基因組水平，缺乏轉(zhuǎn)錄組水平的研究?；蚪M水平的HBV整合突變影響基因轉(zhuǎn)錄的方式和程度尚不明確;前基因組RNA的合成與逆轉(zhuǎn)錄是HBV復(fù)制的關(guān)鍵步驟，目前不能確定在相關(guān)過(guò)程中病毒RNA是否可以直接整合到人體RNA鏈。其次，個(gè)體間的HBV突變譜差異較大，阻礙了HBV整合突變的有效檢測(cè)和全面分析。第三，目前僅有TERT和MLL4基因被證實(shí)為常見的HBV整合基因，上述2種基因中的HBV整合突變僅占此類突變總量的2

3、％以下;其余大量HBV整合突變的促癌功能尚待研究。最后，HBV整合的發(fā)生機(jī)制也不明確。載脂蛋白BmRNA編輯多肽3家族(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide3，APOBECE3)是誘導(dǎo)體細(xì)胞突變和病毒突變產(chǎn)生的重要分子，可以誘導(dǎo)人體和病毒核酸鏈斷裂，但是尚無(wú)研究闡明APOBEC3對(duì)HBV整合的作用。HBV-HCC的發(fā)生發(fā)展是遺傳、免疫和病毒因素共同作用的進(jìn)化

4、過(guò)程。研究APOBEC3的單核甘酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）在病毒突變和癌癥發(fā)生中的作用對(duì)明確HBV致癌過(guò)程有重要意義。
　　研究目的:
　　明確HBV整合在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平的分布規(guī)律;研究HBV整合的發(fā)生機(jī)制以及這類突變?cè)诟渭?xì)胞癌進(jìn)化過(guò)程中的作用;闡明APOBEC3致突變基因與HBV整合的關(guān)系;分析APOBEC3遺傳多態(tài)性與病毒清除、病毒突變和HCC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性;為HB

5、V感染者的癌癥防治提供新靶點(diǎn)。
　　研究方法:
　　應(yīng)用50例HCC患者的癌和癌旁組織進(jìn)行HBV-捕獲測(cè)序以及RNA測(cè)序。以HBV各基因型的標(biāo)準(zhǔn)序列為基礎(chǔ)，利用患者體內(nèi)的HBV突變信息進(jìn)行校正，生成每個(gè)患者個(gè)體化的病毒參考序列。將測(cè)序片段與人核基因組、線粒體基因組以及病毒基因組參考序列進(jìn)行比對(duì)，確定HBV整合突變。隨機(jī)挑選80個(gè)DNA和RNA水平的整合位點(diǎn)，以巢式PCR和Sanger測(cè)序的方法進(jìn)行驗(yàn)證。分別利用標(biāo)準(zhǔn)化配對(duì)測(cè)序

6、片段數(shù)(support PE-assembled reads，NNSS)和嵌合測(cè)序片段數(shù)(reads)評(píng)價(jià)DNA和RNA水平的整合突變信號(hào)強(qiáng)度。在DNA水平，NNSS≥1的HBV整合突變納入分析;在RNA水平，reads≥2的HBV整合突變納入分析。以x2檢驗(yàn)分析HBV整合突變?cè)谌嘶蚪M、病毒基因組以及人群間的分布特征。為排除低頻隨機(jī)整合的影響，以HBV整合突變信號(hào)強(qiáng)度的上四分位點(diǎn)為界值，篩選高強(qiáng)度的整合突變，重復(fù)驗(yàn)證HBV整合突變分布

7、規(guī)律。采用Wilcoxon非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析HBV整合突變的數(shù)量差異;以t檢驗(yàn)或方差分析評(píng)價(jià)基因表達(dá)水平的差異;以Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析APOBEC3表達(dá)與HBV整合突變的相關(guān)性;以Log-Rank檢驗(yàn)評(píng)價(jià)HBV整合突變對(duì)HCC患者預(yù)后及復(fù)發(fā)的影響;以KEGG和GSEA分析確定HBV整合突變顯著影響的信號(hào)通路和生物功能。P＜0.05則判定差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。下載HCC人群的高通量測(cè)序和表達(dá)譜公共數(shù)據(jù)庫(kù)，包括HBV捕獲測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)（S

8、RP068532，426例樣本）、癌癥基因組聯(lián)盟(The Cancer Genome Atlas，TCGA)的HCC隨訪隊(duì)列數(shù)據(jù)庫(kù)(LIHC，366例)以及基因表達(dá)數(shù)據(jù)集(Gene Expression Omnibus，GEO)的HCC表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（GSE14520，242例）。利用上述數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)本研究發(fā)現(xiàn)的HBV整合突變規(guī)律及功能進(jìn)行驗(yàn)證。挑選APOBEC3A、APOBEC3B、以及DNA修復(fù)基因UNG的4個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行研究。使用熒光

9、定量PCR的方法對(duì)1449例健康對(duì)照和3772例HBV感染者（包括1271例HCC患者）進(jìn)行SNP分型，使用巢式PCR擴(kuò)增病毒preS和BCP區(qū)片段，使用MEGA軟件分析病毒突變。用logistic回歸計(jì)算SNP基因型與病毒清除、病毒突變以及HCC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。
　　研究結(jié)果:
　　1.DNA和RNA水平的HBV整合規(guī)律有顯著差異
　　以HBV突變信息校正參考序列，可以提高HBV整合事件的檢出率。本研究在基因組和轉(zhuǎn)錄組

10、水平分別檢測(cè)到HBV整合突變2777個(gè)和2918個(gè)。在DNA水平，癌癥組織中的HBV整合數(shù)量顯著高于癌旁組織(P=1.0×10-4);HCC術(shù)后未復(fù)發(fā)人群→HCC術(shù)后晚期復(fù)發(fā)人群（大于2年）→HCC術(shù)后早期復(fù)發(fā)人群（小于等于2年）的癌癥組織中，HBV整合突變數(shù)量逐漸升高。在RNA水平，癌癥組織中的HBV整合數(shù)量顯著少于癌旁組織(P=1.2×10-3);各HCC進(jìn)化階段的人群之間，HBV整合突變數(shù)量沒(méi)有顯著差別。DNA水平的HBV整合突變

11、僅有0.5％分布在線粒體基因組，而RNA水平的HBV整合突變則有19.43％分布在線粒體基因組。這一差別在驗(yàn)證隊(duì)列中得到重復(fù)。
　　2、HBV X片段是整合入人體基因組的主要片段
　　HBV X區(qū)(nt1374-nt1835)的整合事件數(shù)在DNA水平、RNA線粒體基因組水平以及RNA核基因組水平的比例分別為31.6％，35.1％，以及58.0％，顯著高于隨機(jī)整合率(14％)。在高信號(hào)強(qiáng)度的HBV整合突變中，HBV X片段的比

12、例更高。
　　3、HBV高頻整合基因
　　在DNA水平，292個(gè)基因在≥2個(gè)樣本中均檢測(cè)到HBV整合突變，定義為重復(fù)整合基因;其中僅有11個(gè)(3％)在RNA水平也被鑒定為重復(fù)整合基因;只有2個(gè)(MLL4和TERT，0.6％)可以在同一樣本的DNA和RNA數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)高度一致的HBV整合突變。在DNA水平，TERT的HBV整合突變檢出率最高(16％)，全部分布在啟動(dòng)子區(qū)。在RNA水平，ALB的HBV整合檢出率最高(51％);同時(shí)

13、，全部13個(gè)線粒體編碼基因均發(fā)生了HBV整合突變，而且重復(fù)檢出率均在13.2％-43％。
　　4、HBV整合與基因表達(dá)的相關(guān)性
　　在DNA水平，TERT啟動(dòng)子區(qū)的HBV整合與TERT基因在癌癥組織中的表達(dá)升高有關(guān)(P=3.89×10-8);同時(shí)TERT上游3kb區(qū)域中HBV X片段的反向插入也有促進(jìn)TERT表達(dá)的趨勢(shì);MLL4、MT-ND4等重復(fù)整合基因的表達(dá)水平與HBV在DNA鏈的整合無(wú)關(guān)。在RNA水平，MLL4、ALB

14、、HP、MT-CO2和MT-CYB上的HBV整合突變與基因表達(dá)水平升高有顯著相關(guān)性。
　　5、HBV整合突變相關(guān)的信號(hào)通路
　　DNA水平的整合突變顯著富集于PI3K-mTOR通路和染色質(zhì)重塑通路，通路整體整合突變率分別為30％和20％。RNA水平的整合突變顯著富集于IL2-STAT5和IL6-STAT3等炎癥通路。
　　6、HBV整合對(duì)HCC預(yù)后的影響
　　癌旁組織中DNA水平的HBV整合總數(shù)過(guò)高預(yù)示早期復(fù)發(fā)(

15、P=0.012)，該作用在驗(yàn)證隊(duì)列中得到重復(fù)(P=0.014)。RNA水平上，癌旁組織中核基因組以及線粒體基因組上的整合突變總數(shù)過(guò)高，均可以預(yù)示HCC患者整體生存預(yù)后不良(P=0.027，0.033)。
　　研究結(jié)論:
　　1、HBV整合突變的分布規(guī)律在DNA和RNA水平存在顯著差異，絕大多數(shù)RNA水平的HBV整合突變不是由DNA的整合突變轉(zhuǎn)錄而來(lái)，而是在RNA鏈上直接插入病毒片段導(dǎo)致。
　　2、RNA水平的HBV整合

16、顯著影響線粒體有氧氧化呼吸鏈的相關(guān)基因，DNA水平的HBV整合基因顯著富集致癌通路;基因組和轉(zhuǎn)錄組水平的HBV整合事件數(shù)量過(guò)高均與預(yù)后不良有顯著相關(guān)性，初步明確了HBV整合的促癌作用。
　　3、發(fā)現(xiàn)RNA水平整合突變的發(fā)生與致突變基因APOBEC3A、APOBEC3B的表達(dá)呈正相關(guān)，同時(shí)也與體內(nèi)炎癥免疫通路密切相關(guān);初步證明炎癥通路刺激下誘變分子表達(dá)升高可以促進(jìn)HBV整合突變的產(chǎn)生。
　　4、APOBEC3A、APOBEC3