痕量乙肝病毒感染與肝細(xì)胞癌的關(guān)系及其免疫傳感檢測.pdf

1、乙肝病毒(HBV)感染和肝細(xì)胞肝癌(HCC)關(guān)系密切，有數(shù)據(jù)顯示其相關(guān)性高達(dá)80％，HBV感染者發(fā)生HCC的危險(xiǎn)性是沒有感染乙肝病毒者的200多倍。因此，抗乙肝病毒治療也被認(rèn)為是治療肝細(xì)胞肝癌最基本的病因治療而被廣泛應(yīng)用于圍手術(shù)期。抗病毒治療可以通過抑制乙肝病毒的復(fù)制來減輕肝臟損害，也明顯提高了肝癌的治療效果。但是我們在臨床上發(fā)現(xiàn)有部分肝細(xì)胞肝癌患者其乙肝病毒血清學(xué)檢查呈全陰性，這部份患者似乎從來沒有感染過乙肝病毒，抗乙肝病毒治療也就無

2、法實(shí)施。也正是因?yàn)檫@些患者的肝癌發(fā)生機(jī)制不明，所以我們在臨床上除了給予外科治療以外，缺乏具有針對病因的進(jìn)一步有效治療措施。
　　 乙肝病毒感染在全球廣泛分布。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，全球目前有超過20億人口受到過感染。我國作為乙肝高發(fā)地區(qū)，更是有約10％的人口HBsAg呈陽性，因此，在我們生活中乙肝病毒實(shí)際上是無處不在的，上述乙肝陰性的肝癌患者曾經(jīng)接觸少量或痕量的乙肝病毒是完全有可能的。乙肝病毒通過其DNA低頻率隨機(jī)整合到宿主

3、肝細(xì)胞基因組，引起宿主DNA的缺失、重排與轉(zhuǎn)位，最終引起染色體的畸變或結(jié)構(gòu)異常，激活癌基因而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。也就是說只要有乙肝病毒基因整合到肝細(xì)胞就有可能導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。我們設(shè)想這部分患者曾經(jīng)被少量甚至只有痕量的乙肝病毒入侵，因?yàn)椴《玖可俣鴽]有引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，但是發(fā)生了病毒與患者肝細(xì)胞的基因整合才導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。如能證實(shí)我們的設(shè)想，則對肝癌發(fā)生的病因?qū)W研究是一極大的貢獻(xiàn)，對臨床肝癌的治療也具有重要的指導(dǎo)意義。
　　 目前檢測

4、乙肝HBsAg的常用方法是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)，其靈敏度一般認(rèn)為最高可以達(dá)到0.5-1ng/ml，但是對HBsAg含量低于0.5ng/ml的血液標(biāo)本就提示陰性結(jié)果。這對于痕量乙肝病毒的檢測極為不利，如可以影響到對獻(xiàn)血者血液標(biāo)本是否帶有乙肝病毒的判斷，因?yàn)橛匈Y料顯示含有0.1 ng/mL HBsAg的血液就具有傳染性。因此發(fā)展高靈敏、選擇性更好的免疫分析技術(shù)用于痕量乙肝病毒的檢測具有重要意義。
　　 電化學(xué)免疫傳感器是利

5、用抗原與抗體間的高度特異性結(jié)合，將免疫分析法與電化學(xué)傳感器相結(jié)合，具有靈敏度高，分析速度快，操作簡便、價(jià)格低廉及選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。納米技術(shù)是用單個(gè)原子、分子制造物質(zhì)的科學(xué)技術(shù)。其主要針對1～100nm之間的尺寸，該尺寸處在原子、分子為代表的微觀世界和宏觀物體交界的過渡區(qū)域，突出表現(xiàn)為表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)四大效應(yīng)。由于納米材料的獨(dú)特的性質(zhì)，使得傳感器成為納米材料目前最有前途的應(yīng)用領(lǐng)域之一。納米微粒的特點(diǎn)能夠與傳感器

6、所要求的多功能、微型化、高速化等相互對應(yīng)。另外，作為傳感器材料，還要求功能廣、靈敏度高、響應(yīng)速度快、檢測范圍寬、選擇性好、耐負(fù)荷性高、穩(wěn)定可靠，納米微粒正好具備上述的特性。在免疫傳感器的研究中，生物分子的固定化方法是構(gòu)建性能優(yōu)良的傳感器較為關(guān)鍵的步驟。由于納米材料的獨(dú)有特性，納米技術(shù)給免疫傳感器的發(fā)展帶來了極大的促進(jìn)作用，它可以廣泛地應(yīng)用于敏感分子的固定，信號的檢測和放大，吸附能力的增強(qiáng)以及反應(yīng)速度的提高。利用納米材料的特性制作的全新的

7、免疫傳感器與傳統(tǒng)的相比，新型納米級的免疫傳感器具備測量裝置簡單、操作簡易、靈敏度高、精度高、可靠性好、響應(yīng)時(shí)間快等優(yōu)點(diǎn)，并且可以實(shí)現(xiàn)定量的實(shí)時(shí)檢測分析。
　　 我們試圖將電化學(xué)免疫傳感器與納米生物技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)出一種高靈敏度的HBsAg檢測系統(tǒng)用于痕量乙肝病毒的檢測。
　　 研究目的：
　　 1、分析首診為乙肝病毒感染患者的流行病學(xué)特征，探討其易感因素和可能的傳播途徑。
　　 2、通過檢測不同患者肝癌標(biāo)

8、本中HBx基因的表達(dá)，尋找乙肝病毒感染證據(jù)，以明確痕量乙肝病毒在血清學(xué)檢測全陰性患者的肝癌發(fā)生中所起的作用。
　　 3、將HBsAb標(biāo)記到辣根過氧化物酶(HRP)摻雜的納米金顆粒表面，使用夾心免疫分析方法，建立一種簡單又高靈敏的電化學(xué)免疫分析方法來檢測人血清中HBsAg的水平。
　　 研究內(nèi)容和方法：
　　 1、重慶地區(qū)首診為乙肝感染患者的流行病學(xué)特征分析
　　 選擇我院2009年1月1日至2009年12

9、月31日門診與住院全部患者中首次證實(shí)診斷為乙肝感染的患者486名，以他們?yōu)檠芯繉ο蟆ａ槍π詣e、年齡、職業(yè)、居住地等的分布情況，以及有無乙肝家族史、有無輸血史，有無接種乙肝疫苗史等差異開展調(diào)查，進(jìn)而利用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述與差異分析。
　　 2、HBx基因在血清學(xué)陰性的肝癌患者肝癌組織中的表達(dá)研究
　　 我院2009年1月-2010年3月期間手術(shù)切除肝癌(HCC)及癌旁組織標(biāo)本共72例。根據(jù)血清學(xué)檢測乙肝標(biāo)志物結(jié)果

10、進(jìn)行分組，應(yīng)用RT-PCR法檢測組織中HBx mRNA的表達(dá)差異，應(yīng)用Western-blot法檢測組織中HBx蛋白的表達(dá)差異，通過比較各組間的表達(dá)差異以證實(shí)乙肝病毒在肝癌發(fā)生中的作用。
　　 3、基于納米金和辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體的新型電導(dǎo)型免疫傳感器的建立及在痕量HBsAg檢測上的應(yīng)用
　　 制備以納米金顆粒作為殼的納米金修飾微電極，將HBsAb標(biāo)記到辣根過氧化物酶(HRP)并摻雜到納米金顆粒表面，合成了雙重納米金顆

11、粒。再以過氧化氫作為酶底物，使用夾心免疫分析方法，其檢測信號主要來自與納米金標(biāo)記的辣根過氧化物酶，實(shí)現(xiàn)對人體血清HBsAg的檢測，觀察免疫反應(yīng)前后電流的變化與HBsAg的濃度的正比關(guān)系。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、首診為乙肝感染患者的流行病學(xué)特征分析
　　 1.1性別差異明顯，男性明顯多于女性，這與乙肝發(fā)病特征吻合。
　　 1.2年齡分布以30-60歲為高峰。一方面提示我國乙肝病人的普查較滯后，發(fā)現(xiàn)病情

12、較晚，另一方面提示我國多數(shù)患者并不是因?yàn)槟笅雮鞑セ蚋腥居谟啄昶?，而是成年后于環(huán)境中接觸病毒而感染。
　　 1.3居住地分布情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)人口密集程度對乙肝感染人群分布有一定影響。
　　 1.4職業(yè)分布情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)農(nóng)、林、牧、漁、水利業(yè)生產(chǎn)人員與自由職業(yè)者、民工發(fā)病比例最高，在城市里有固定工作的人群相對于農(nóng)民和城市里工作流動(dòng)性大的人群明顯較少，職業(yè)的差異對乙肝感染影響明顯。
　　 1.5乙肝家族史、輸血史，乙肝疫苗接

13、種史對乙肝病人分布影響明顯。
　　 2、HBx基因在血清學(xué)陰性的肝癌患者肝癌組織中的表達(dá)研究
　　 2.1 RT-PCR法檢測HBx mRNA，結(jié)果顯示血清學(xué)全陰性肝癌患者其標(biāo)本中有明顯的表達(dá)，與正常人群差異明顯。
　　 2.2 Western-blot法檢測HBx蛋白，結(jié)果顯示血清學(xué)全陰性肝癌患者其標(biāo)本中有明顯表達(dá)，與正常人群差異明顯。
　　 3、基于納米金和辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體的新型電導(dǎo)型免疫傳感器

14、應(yīng)用于痕量乙肝表面抗原檢測的研究
　　 3.1成功制備以納米金顆粒作為殼的納米金修飾微電極。
　　 3.2成功將HBsAb標(biāo)記到辣根過氧化物酶(HRP)摻雜到納米金顆粒表面，合成了雙重納米金顆粒。
　　 3.3以過氧化氫為酶底物，以納米金標(biāo)記的辣根過氧化物酶為主要檢測信號，使用夾心免疫分析法成功構(gòu)建了用于人體血清HBsAg檢測的電導(dǎo)型免疫傳感器，該免疫傳感器的線性范圍為0.1-600 ng/mL HBsAg，檢測

15、下限為0.01 ng/mL。
　　 結(jié)論：
　　 1、對乙肝病毒感染首診病人的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)由于缺乏乙肝疫苗的保護(hù)，目前在成年人群中的HBV感染與傳播較為嚴(yán)重，而且職業(yè)、居住地等環(huán)境因素影響明顯。
　　 2、痕量乙肝病毒可以侵入宿主肝細(xì)胞，并可能通過基因整合(HBx的整合)，導(dǎo)致肝細(xì)胞的癌變。這可能是血清學(xué)乙肝病毒檢測全陰性的肝癌患者的發(fā)病機(jī)制。
　　 3、目前常用的ELISA法檢測HBsAg準(zhǔn)確、迅速