乙肝病毒體外自然感染人骨髓間充質(zhì)干細胞的研究.pdf

1、[研究背景]
　　 乙型病毒性肝炎，簡稱乙肝，是一種由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)引起的世界范圍傳播的疾病。乙型肝炎主要通過與被感染的人的血液和其它體液的接觸傳染。HBV感染是引起慢性肝病、肝硬化、肝細胞肝癌的主要原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全世界有20億人感染過HBV，其中3.6億以上為慢性感染，每年大約有60萬人死于HBV感染的相關(guān)性肝病及肝細胞肝癌。注射對抗HBV感染的疫苗是目前有效預(yù)防HBV的最佳

2、手段，但是仍然不能阻止HBV的傳播。HBV自然感染的宿主范圍狹窄，只局限于人類和大猩猩，因此目前HBV的研究缺少合適的動物模型，HBV的研究更多的依賴于細胞模型。HBVDNA轉(zhuǎn)染的肝癌細胞系是體外研究HBV的結(jié)構(gòu)與功能、基因表達與調(diào)控，以及藥物篩選及耐藥機制的有力工具，然而病毒進入肝癌細胞系的方式不是正常的感染而是轉(zhuǎn)染或者整合，因此肝癌細胞系不能用于研究早期病毒-靶細胞的相互作用（例如病毒的吸附，穿入、脫衣殼等）。原代人肝細胞對HBV有

3、著天然的易感性，但是來源有限（新鮮的肝臟組織），體外培養(yǎng)困難（不能傳代、肝細胞特殊形態(tài)不能維持）等缺點限制了其做為細胞模型的可能。最近幾年，與肝細胞相關(guān)的干細胞因為其強大的增殖能力和固有的生物學(xué)特性引起了人們的重視，肝細胞起源于骨髓細胞，骨髓細胞被視為肝細胞再生的重要源泉。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone-marrowmesenchymalstemcells，BMSCs)在特殊的誘導(dǎo)條件下體外能夠誘導(dǎo)成具有肝功能的成熟的類肝細胞，動物模型顯示

4、移植入體內(nèi)的誘導(dǎo)前或者誘導(dǎo)后的BMSCs均能恢復(fù)受損的肝細胞。但是人BMSCs是否對HBV易感，是否能成為研究HBV的細胞模型目前尚未有報道。本研究用HBV體外自然感染人BMSCs，探討人BMSCs做為細胞模型研究HBV最初生命過程、HBV生物學(xué)特性、HBV與宿主細胞相互作用的早期機制及HBV耐藥機制的可能性。
　　 本研究分為2個部分:
　　 第一部分，人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和純化
　　 [目的]

5、>　　 探討從人骨髓中分離、培養(yǎng)、純化、擴增BMSCs的方法，建立穩(wěn)定的人BMSCs，為后續(xù)HBV研究提供可靠的細胞模型。
　　 [方法]
　　 1.密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法及酶消化控制法分離、培養(yǎng)、純化人BMSCs。
　　 2.觀察人BMSCs的細胞形態(tài)學(xué)特點，繪制人BMSCs(P5)的生長曲線，計算細胞對數(shù)生長期倍增時間。
　　 3.流式細胞術(shù)檢測人BMSCs(P5)的群體DNA含量分布（細胞周

6、期），常見的表面標(biāo)志物。
　　 4.評估人BMSCs的傳代、凍存和復(fù)蘇的能力。
　　 [結(jié)果]
　　 1.成功分離培養(yǎng)了人BMSCs。細胞貼壁生長，形態(tài)均一，以梭形為主，邊界清晰，胞核飽滿居中，多成橢圓形，細胞排列具有一定方向性，密度高時成漩渦狀或放射狀排列。
　　 2.人BMSCs生長增殖旺盛，體外能長期培養(yǎng)擴增，生長曲線呈典型的“S”型，細胞對數(shù)生長期倍增時間為31h。符合間充質(zhì)干細胞的特性。

7、　　 3.流式細胞術(shù)示人BMSCs細胞周期大部分處于靜止期，小部分處于分裂周期，具有強大的增殖潛力;人BMSCs穩(wěn)定高表達CD90、CD105，不表達CD34、CD45。符合間充質(zhì)干細胞的特性。
　　 4.人BMSCs可凍存，復(fù)蘇后細胞形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性穩(wěn)定，細胞生長增殖旺盛。符合細胞模型的特點。
　　 [結(jié)論]
　　 體外培養(yǎng)的人BMSCs生長穩(wěn)定，增殖旺盛，能連續(xù)傳代，可用于進一步的組織工程、細胞模型和分子

8、生物學(xué)研究。
　　 第二部分，乙肝病毒體外自然感染人骨髓間充質(zhì)干細胞
　　 [目的]
　　 評估HBV體外自然感染人BMSCs后的復(fù)制、合成、表達能力，探討人BMSCs做為細胞模型用于研究HBV的可能性。
　　 [方法]
　　 1.HBVDNA陽性(5.4×108copies/mL)的患者血清孵育培養(yǎng)的人BMSCs，感染細胞。
　　 2.熒光定量PCR方法檢測HBV陽性血清孵育后的人BMS

9、Cs是否合成、分泌HBVDNA。
　　 3.DNA印跡法(Southernblotting)檢測HBV是否在感染后的人BMSCs內(nèi)有效復(fù)制，形成復(fù)制中間體:共價閉合環(huán)狀DNA(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)。
　　 4.電化學(xué)發(fā)光法檢測HBV陽性血清孵育后的人BMSCs是否表達、分泌乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)。
　　 5.間接免疫熒光方法檢測HBV

10、陽性血清孵育后的人BMSCs是否合成、表達乙肝病毒核心抗原(HBcAg)。
　　 6.阻斷實驗:將含10％的感染血清的雙無培養(yǎng)基加入不同稀釋度的抗HBsAg的特異性抗體按前述感染方法孵育人BMSCs檢測病毒進入細胞的途徑。
　　 [結(jié)果]
　　 1.HBV成功自然感染人BMSCs，感染后細胞形態(tài)學(xué)穩(wěn)定，生長增殖旺盛。
　　 2.HBV陽性血清孵育后的第2天人BMSCs可以檢測到HBVDNA，第6-12天維

11、持在相對高的水平，HBVDNA最高值為9.37×105copies/mL;HBV陽性血清孵育后的第3-15天BMSCs培養(yǎng)上清中可以檢測到HBVDNA，HBVDNA的含量分布在3.792×102copies/mL和4.067×105copies/mL之間。
　　 3.Southernblotting檢測顯示人BMSCs在HBV陽性血清孵育后第2天就可檢測到HBVcccDNA的微弱信號(2.0kb)，陽性信號隨著培養(yǎng)進程的推進而增

12、強。
　　 4.HBV陽性血清孵育后的人BMSCs能夠持續(xù)分泌HBsAg和HBeAg到培養(yǎng)上清中。感染后第2-16天培養(yǎng)上清中能檢測到HBsAg，最低值是1.612IU/mL，最高值是118.100IU/mL;感染后第5-13天培養(yǎng)上清中能檢測到HBeAg呈陽性表達;HBeAg檢測最低值是0.115s/co(absorbancerate/cut-offratio)，最高值是3.407s/co（≥1s/co為陽性）。
　　

13、 5.HBV陽性血清孵育后的第2天開始人BMSCs可以檢測到HBcAg。間接免疫熒光染色表現(xiàn)為胞漿內(nèi)強烈的彌漫性著色，細胞核部分著色，大約7％的細胞核呈陽性表達，且數(shù)目隨著培養(yǎng)進程的推進而增多，第9天達高峰，大約20％的細胞核呈陽性表達。
　　 6.抗HBsAg的抗體能夠阻斷HBV進入人BMSCs，阻斷率與抗HBsAg的抗體的濃度有明顯的量效關(guān)系。
　　 [結(jié)論]
　　 人BMSCs對HBV自然感染易感，能在病毒