人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體在骨髓和臍血間充質(zhì)干細(xì)胞檢測中的應(yīng)用.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BM-MSCs)是不同于造血干細(xì)胞的另一類骨髓干細(xì)胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能，在一定的體內(nèi)或體外誘導(dǎo)條件下，可以分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞。最近研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞具有弱的免疫原性和很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，這些生物學(xué)特性使其在組織工程、基因治療、細(xì)胞移植等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。 本課題組以人BM-MSCs

2、為免疫原，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了四種抗人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體，分別命名為ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUF10。研究已證實(shí)四種單克隆抗體與骨髓來源的8個細(xì)胞株(HL-60、NB4、K562、U937、HEL、Jurkat、Raji、KM3)和11種人間充質(zhì)組織和非間充質(zhì)組織標(biāo)本(韌帶、肌腱、神經(jīng)、脂肪、肌肉、血管壁、表皮、肺、肝、小腸、膽囊)均無交叉反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用四種單克隆抗體通過免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色法、免疫熒光染色法、間接流式細(xì)

3、胞術(shù)、免疫印跡法檢測骨髓和臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，鑒定四種單克隆抗體與MSCs反應(yīng)的特異性和敏感性，希望建立一種有效的MSCs檢測方法。 本研究采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)的方法獲取骨髓和臍血間充質(zhì)干細(xì)胞。骨髓MSCs形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似，成梭形，原代培養(yǎng)2～3周后達(dá)80～90％融合，排列有明顯方向性，成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀，傳代后細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化。臍血MSCs原代培養(yǎng)建立時間較長，4周左右達(dá)80～90％融合，形態(tài)與骨髓MSCs相

4、似，但較骨髓MSCs稍小。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的骨髓和臍血MSCs均高表達(dá)CD29、CD105、CD44和CD166，不表達(dá)CD14、CD34、CD45和HLA-DR。骨髓和臍血MSCs在成骨誘導(dǎo)分化劑、脂肪誘導(dǎo)分化劑和硫代甘油誘導(dǎo)下分別成功地分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞。證實(shí)本研究體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增的細(xì)胞確系具有多向分化潛能的MSCs。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用四種人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單克隆抗體(ZUB1、ZUB4、ZUC

5、3、ZUF10)通過免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色法、免疫熒光染色法、間接流式細(xì)胞術(shù)、免疫印跡法檢測骨髓和臍血MSCs，結(jié)果表明四種單克隆抗體均能與骨髓和臍血MSCs結(jié)合，具有較高的特異性和敏感性。 免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色法結(jié)果顯示四種單克隆抗體均能與骨髓和臍血MSCs特異性結(jié)合，ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUF10在檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的陽性率分別為(97.44±1.39)％、(96.56±0.77)％、(98.67±0.58)％、(98

6、.33±1.15)％，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的陽性率分別為94.5％、93.5％、95.84％、95.67％。 間接免疫熒光染色法在熒光顯微鏡下觀察活染的骨髓和臍血MSCs，結(jié)果顯示四種單克隆抗體均可與骨髓和臍血MSCs特異性結(jié)合，與FITC熒光二抗結(jié)合后胞膜呈現(xiàn)特異性綠色熒光；四種單克隆抗體檢測骨髓MSCs的陽性率達(dá)95％左右，臍血MSCs的陽性率達(dá)90％左右。 分別以ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUF10為探針，間接流式

7、細(xì)胞術(shù)檢測體外培養(yǎng)的骨髓和臍血MSCs，四種單克隆抗體檢測骨髓MSCs的陽性率分別為(90.93±3.21)％、(82.35±4.14)％、(93.22±1.09)％、(87.10±3.83)％，臍血MSCs的陽性率分別為75.89％、66.95％、77.37％、77.53％。 提取體外培養(yǎng)的骨髓和臍血MSCs總蛋白，應(yīng)用四種單克隆抗體通過免疫印跡法檢測相應(yīng)抗原的表達(dá)，結(jié)果顯示骨髓和臍血MSCs標(biāo)本ZUB1、ZUB4、ZUC3、

8、ZUF10分別在蛋白標(biāo)記72kDa、170kDa、33kDa、72kDa附近檢測到一條特異性陽性條帶，骨髓和臍血MSCs條帶位置一致。 綜上所述，本研究結(jié)果表明①四種單克隆抗體均能與骨髓MSCs結(jié)合，具有高度的特異性和敏感性，以其中的任何一個作為單一標(biāo)記均可用于檢測骨髓MSCs，其對人骨髓MSCs的檢測優(yōu)于目前普遍應(yīng)用的多個表面分子聯(lián)合標(biāo)記的方法。②四種單克隆抗體可穩(wěn)定應(yīng)用于免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色法、免疫熒光染色法、流式細(xì)胞術(shù)和免疫