戊型肝炎病毒ORF2編碼蛋白N562糖基化及其突變的生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、我國于2012年戊型肝炎發(fā)病人數(shù)已超過甲型肝炎發(fā)病人數(shù)，成為一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此，加強(qiáng)戊型肝炎疫苗的研發(fā)并及時推廣應(yīng)用對預(yù)防和控制戊型肝炎意義重大。
　　本研究用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)替代原先的大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，分泌性表達(dá)含N562糖基化位點的pORF2的p179疫苗片段，并同時表達(dá)針對N562糖基化位點的p179突變體，進(jìn)而研究糖基化p179與點突變的p179在二聚體形成、抗原性、免疫原性以及誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生等方面的異

2、同，以深入了解HEV結(jié)構(gòu)蛋白pORF2的生物學(xué)特征，尋求更為安全有效的戊型肝炎重組疫苗。本研究主要分為3個部分:
　　一、HEV pORF2 N562潛在糖基化位點氨基酸基序的同源性分析
　　為了解HEV結(jié)構(gòu)蛋白pORF2 N562潛在糖基化位點的保守性或變異程度，我們首先從GenBank下載了共210個HEV1、2、3、4基因型及兔HEV、鼠HEV毒株的序列，利用生物信息學(xué)軟件Lasergene7.0對210個包含HEV結(jié)

3、構(gòu)蛋白pORF2 N562的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6株毒株(GenBank accession numbers: AB189070，AB425831，AB593690，AB698071，AB740232和JQ026407)在N562位點糖基化基序由562NTT變成了562DTT，這6株毒株的共同之處是它們均為來源于日本的基因3型毒株。說明HEV結(jié)構(gòu)蛋白pORF2 N562潛在糖基化位點基序N-X-T在具有高度保守性的同時尚

4、具有一定的變異性。隨著越來越多的新HEV毒株的出現(xiàn)，pORF2 N562潛在糖基化位點的氨基酸基序有可能發(fā)生其他更多的變異。
　　二、p179及其N562突變體的畢赤酵母分泌性表達(dá)和特性分析
　　我們首先在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上采用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)分泌性表達(dá)野生型p179，同時通過重組PCR技術(shù)將N562進(jìn)行4種定點突變，分別用酰胺類的谷氨酰胺(Q)、酸性氨基酸類的天冬氨酸(D)、亞氨基酸類的脯氨酸(P)和芳香族類的酪氨

5、酸(Y)替代野生型的天冬酰胺(N)，改變潛在糖基化位點的氨基酸保守性基序，并在畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行分泌性表達(dá)。表達(dá)獲得的p179蛋白分別命名為p179N562、p179N562Q、p179N562D、p179N562P和p179N562Y，通過SDS-PAGE結(jié)合衣霉素(tunicamycin)糖基化干預(yù)試驗分析野生型p179N562和其突變體的糖基化修飾以及糖基化修飾對p179空間結(jié)構(gòu)的影響。最后分別與抗-HEV特異性單克隆抗體

6、及戊型肝炎恢復(fù)期病人血清(抗HEV IgG陽性)進(jìn)行Western blot反應(yīng)，評價糖基化和去糖基化對p179蛋白免疫反應(yīng)性的影響。結(jié)果如下:
　　A.利用重組PCR技術(shù)成功將HEV pORF2中的N562進(jìn)行定點突變，突變?yōu)轷０奉惖墓劝滨０?、酸性氨基酸類的天冬氨酸、亞氨基酸類的脯氨酸、芳香族類的酪氨酸，?jīng)測序驗證。應(yīng)用PSIPRED方法分析預(yù)測p179N562及p179N562Q、p179N562D、 p179N562P、p1

7、79N562Y蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果均以無規(guī)卷曲為主，其次為β折疊，最后為α螺旋。HEV p179N562和HEVORF2p179N562Q、 p179N562D、 p179N562P二級結(jié)構(gòu)一致，其中無規(guī)卷曲占61.45％、β折疊占35.20％、α螺旋占3.35％。p179N562Y與其他四種蛋白的二級結(jié)果略有差異，其中無規(guī)卷曲占60.34％、β折疊占36.31％、α螺旋占3.35％，第559與560位氨基酸由原來的無規(guī)卷曲變?yōu)棣抡郫B。

8、
　　B.利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了分別含HEV p179野生型及其突變體的pPICZαA重組質(zhì)粒，并在畢赤酵母菌株SMD1168中實現(xiàn)了分泌性表達(dá)。SDS-PAGE顯示p179N562、p179N562Q和p179N562D呈二聚體，分子質(zhì)量分別為48kDa、42kDa和42kDa;蛋白樣品加熱處理后均變?yōu)閱误w，分子質(zhì)量分別為24kDa、21KDa和21KDa。無論是二聚體還是單體，野生型p179N562的分子質(zhì)量均高于突變體，

9、提示p179N562在酵母細(xì)胞真核表達(dá)時被糖基化修飾。另外2個突變體p179N562P和p179N562Y無論在天然狀態(tài)下還是經(jīng)加熱處理后均呈單體形式，分子質(zhì)量均為21kDa，不能形成二聚體。
　　C.在衣霉素糖基化干預(yù)試驗中，p179N562經(jīng)衣霉素處理干預(yù)后分子質(zhì)量由原來的48kDa降至42kDa，而p179N562Q、 p179N562D、 p179N562P和p179N562Y的衣霉素干預(yù)組與未干預(yù)組的分子質(zhì)量保持一致，分

10、別還是42kDa、42kDa、21kDa和21kDa，二聚體和單體的特征未發(fā)生改變。進(jìn)一步證實p179N562在酵母細(xì)胞真核表達(dá)時被糖基化修飾，其分子質(zhì)量的增加是N562發(fā)生糖基化的結(jié)果。
　　D.在與HEV中和性單克隆抗體5G5進(jìn)行Western blot反應(yīng)時，p179N562、p179N562Q、p179N562D以二聚體形式與5G5反應(yīng)，經(jīng)加熱變?yōu)閱误w后不與5G5反應(yīng)。p179N562和p179N562Q、p179N562

11、D二聚體不與針對線性表位的單克隆抗體6F9反應(yīng)，但加熱變?yōu)閱误w后能與6F9反應(yīng)。p179N562P、p179N562Y均以單體形式與5G5、6F9反應(yīng)，但兩者經(jīng)加熱后不與5G5反應(yīng)，與6F9的反應(yīng)不受影響。表明p179中和抗原表位的結(jié)構(gòu)和功能與其是否形成二聚體無關(guān)，加熱使二聚體解聚的同時破壞了中和性抗原表位。此外，在雙抗體夾心法檢測酵母培養(yǎng)上清中的p179抗原時，p179N562、 p179N562Q、p179N562D、 p179N5

12、62P與p179N562Y具有良好的抗原性，但p179N562的檢測效果差于突變體，并且這種差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這可能與p179N562增加的糖鏈遮蓋了部分抗原表位有關(guān)。
　　三、p179及其N562突變體的免疫原性和免疫血清的HEV中和作用
　　為進(jìn)一步比較糖基化p179N562與非糖基化的p179突變體的免疫原性，尤其是它們所誘導(dǎo)的免疫血清對HEV中和作用差異，我們將等量的p179N562、p179N562

13、Q、p179N562D、 p179N562P、 p179N562Y分別免疫小鼠，定期采集小鼠血清，用ELISA檢測抗-HEV IgG抗體，觀察抗體的變化直至免疫后40周。此外，我們采用基于PCR的HEV體外中和試驗，來評價p179N562、 p179N562Q、 p179N562D、 p179N562P、 p179N562Y免疫小鼠血清的中和活性。結(jié)果如下:
　　A.p179N562、p179N562Q、 p179N562D、 p

14、179N562P和p179N562Y免疫小鼠后，免疫血清在第3周可以檢測出抗-HEV IgG抗體，大多在免疫后的第8周抗體滴度達(dá)到高峰，此后逐漸下降，但直至免疫后40周各組免疫血清中抗-HEV IgG抗體仍持續(xù)陽性，說明p179N562、p179N562Q、 p179N562D、 p179N562P和p179N562Y具有良好的免疫原性。
　　B.HEV的細(xì)胞培養(yǎng)十分困難，尚無常規(guī)的體外中和試驗，也無敏感小動物模型。我們采用基于一

15、步法RT-PCR的體外中和試驗檢測p179N562、 p179N562Q、 p179N562D、p179N562P和p179N562Y小鼠免疫血清的中和作用，其中和效價分別為1∶20、1∶80、1∶20、1∶640和1∶160，以p179N562P免疫血清的中和作用最強(qiáng)，糖基化的p179N562誘導(dǎo)的中和抗體效價低。
　　綜上所述，我們的研究結(jié)果表明:
　　1.HEV結(jié)構(gòu)蛋白pORF2 N562潛在糖基化位點的氨基酸基序N-

16、X-T具有高度的保守性，但也具有一定的變異性，部分3型毒株由562NTT突變成562DTT，糖基化基序丟失。
　　2.HEV結(jié)構(gòu)蛋白pORF2羧基端片段p179野生型p179N562及其4種N562定點突變體p179N562Q、p179N562D、p179N562P和p179N562Y均能在畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中分泌性表達(dá)，p179N562被糖基化修飾，而突變體不能被糖基化修飾。
　　3.分泌性表達(dá)的野生型p179N562及

17、N562突變成谷氨酰胺的p179N562Q或天冬氨酸的p179N562D均天然形成二聚體，加熱變性則二聚體變成單體，但突變成脯氨酸的p179N562P或酪氨酸的p179N562Y只以單體形式存在。
　　4.所有二聚體p179和天然單體p179均能與中和性單克隆抗體5G5反應(yīng)，但加熱變性后形成的所有單體p179基本不再與5G5反應(yīng)，說明p179中和抗原表位的結(jié)構(gòu)和功能與其是否形成二聚體無關(guān)，加熱處理能夠同時破壞p179的二聚體結(jié)構(gòu)和

18、中和抗原表位。
　　5.野生型糖基化的p179N562以及N562突變體非糖基化的p179N562Q、p179N562D、p179N562P和p179N562Y均具有良好的免疫原性和抗原性，均能誘導(dǎo)HEV中和抗體的產(chǎn)生，說明N562不參與p179中和抗原表位的形成，但N562糖基化的糖鏈有可能對中和抗原表位有部分遮蓋作用，它誘導(dǎo)的中和抗體效價低;非糖基化的N562突變體p179N562P的天然單體誘導(dǎo)中和抗體的效價最高，有可能成為