簡介：目的構(gòu)建人3型腺病毒載體嵌入登革熱病毒抗原表位的重組腺病毒，為人3型腺病毒衣殼嵌合載體的應(yīng)用及登革熱病毒疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。方法人3型腺病毒骨架質(zhì)粒PBRAD△E3GFP為模板，搭橋PCR擴增六鄰體不同超變區(qū)（HVR）嵌入不同血清型登革病毒抗原表位的六鄰體突變基因片段HEXONDENV，突變的六鄰體片段酶切后克隆到穿梭載體。穿梭質(zhì)粒酶切后與線性化的PBRAD△E3GFP電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BJ5183進行同源重組，鑒定后獲得陽性重組腺病毒質(zhì)粒PBRAD△E3GFPDENV。經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定登革病毒抗原表位正確插入相應(yīng)HVR后，中抽質(zhì)粒并酶切線性化后轉(zhuǎn)染AD293細胞包裝重組腺病毒。成功包裝的重組腺病毒經(jīng)大量擴增培養(yǎng)及純化后，進行熱穩(wěn)定性和生長曲線分析，WESTERNBLOT和ELISA實驗分析嵌合的登革病毒抗原表位在六鄰體上表達及在重組腺病毒粒子表面的暴露情況。重組腺病毒免疫BALBC小鼠，通過WESTERNBLOT和ELISA實驗檢測免疫小鼠對重組腺病毒的體液免疫反應(yīng)，微量中和實驗檢測抗血清體外中和登革病毒的作用。結(jié)果通過搭橋PCR擴增出HVR1嵌入登革病毒1型抗原表位、HVR2插入登革病毒3型抗原表位，HVR5嵌入登革病毒2型抗原表位的突變六鄰體片段。成功將突變的六鄰體片段克隆到穿梭載體后酶切線性化，與線性化的腺病毒骨架質(zhì)粒同源重組后，獲得四個重組腺病毒質(zhì)粒。在AD293細胞中成功包裝出在六鄰體HVR1嵌入登革病毒1型抗原表位和在HVR2嵌入登革病毒3型抗原表位的重組腺病毒AD3R1DENV1和AD3R2DENV3，在六鄰體HVR5區(qū)的嵌入登革病毒2型抗原表位的重組腺病毒質(zhì)粒未能成功包裝出重組病毒。重組腺病毒的熱穩(wěn)定性和生長特性不受插入登革病毒抗原表位影響。登革病毒1型和3型抗原表位在六鄰體蛋白融合表達并且暴露在病毒粒子表面。WESTERNBLOT，ELISA結(jié)果顯示重組腺病毒免疫小鼠即誘導(dǎo)登革病毒表位特異性抗體。體外中和實驗中，重組腺病毒免疫的小鼠血清對登革病毒感染C636細胞中和作用微弱。結(jié)論成功構(gòu)建表達登革病毒抗原表位嵌合型人3型重組腺病毒重組腺病毒能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的體液免疫應(yīng)答。

簡介：乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBV慢性感染是全球性的健康問題。全世界共有35億慢性HBV感染者，其中75％為亞洲人。我國流行的HBV基因型主要為C型和B型。河南省漯河地區(qū)和黑龍江省肇東地區(qū)均屬于HBV低度流行地區(qū)，本研究在2005年HBV感染的調(diào)查基礎(chǔ)上研究兩地區(qū)HBV基因型的流行情況和HBVBCP區(qū)和前C區(qū)的變異情況，為兩地區(qū)乙肝防控提供一定的科學(xué)依據(jù)。本研究共分為兩部分第一部分河南省漯河地區(qū)自然人群乙型肝炎病毒基因型的分子流行病學(xué)初步分析目的了解河南省漯河地區(qū)自然人群HBV基因型、血清亞型分布情況及基因型與血清亞型的關(guān)系；分析HBV基因型與臨床類型、HBEAG抗HBE血清學(xué)狀況之間的關(guān)系；分析HBV基因型與血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT的關(guān)系；了解自然人群中HBVS基因的核苷酸水平變異及氨基酸水平變異情況。方法2005年以河南省漯河地區(qū)舞陽縣舞泉鎮(zhèn)、臨潁縣固廂鄉(xiāng)、召陵區(qū)萬金為研究現(xiàn)場，以居民為研究對象，對居民進行了一次橫斷面血清流行病學(xué)調(diào)查。2006年隨訪2005年HBSAG陽性者296人，采用固相放射免疫SPRIA法檢測HBSAG、抗HBS、抗HBC、HBEAG和抗HBE五項乙肝病毒感染指標，綜合ALT、B超和臨床體檢等結(jié)果，按照2005年12月10日制定的慢性乙型肝炎防治指南和衛(wèi)生部傳染病標準專業(yè)委員會2007年提出的乙型病毒性肝炎診斷標準報批稿的診斷標準，選擇可作出明確臨床診斷的254例作為研究對象。其中無癥狀HBV攜帶者144例，慢性乙型肝炎CH110例。男性136例，女性118例。平均年齡35歲。對從254例研究對象中抽取的血清標本采用巢式PCR法擴增HBVDNA。利用QIAAMPDNABLOODMINIKIT，按照試劑盒操作說明書要求從200ΜL血清中提取HBVDNA，以其作為模板，分別設(shè)計合成2對引物擴增HBVS基因。擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，直接將PCR產(chǎn)物送TAKARA利用ABIPRISMTM3730XLDNAANALYZER測序。利用DNASTAR軟件對測序標本的核苷酸序列與從GENBANK中獲取的HBVAH各基因型標準序列進行比對分析，繪制基因進化樹，確定基因型。由核苷酸序列推導(dǎo)氨基酸序列，確定血清亞型。應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件SPSS130進行X2檢驗，F(xiàn)ISHER確切概率法，WILCOXON秩和檢驗對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜005為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果254例血清標本中，HBVS區(qū)陽性者219例，陽性率為8622％。219例標本的基因型分布為B基因型22例，占1005％C型197例，占8995％。血清亞型分布為ADR亞型192例，占8767％；ADW2亞型23例，占1050％；AYR亞型3例，占137％；AYW1亞型1例，占046％。22例B基因型標本的血清亞型為ADW2亞型21例占9545％，AYW1亞型1例占455％197例C基因型標本的血清亞型為ADR亞型192例占9746％，ADW2亞型2例占102％，AYR3例占152％。不同基因型的血清亞型構(gòu)成差異有統(tǒng)計學(xué)意義P00000。22例B基因型感染者中，15例6818％為，7例3182％為CH；197例C基因型感染者中，109例5533％為，88例4467％為CH。不同基因型的臨床類型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義P02487。結(jié)論1河南省漯河地區(qū)的HBV基因型分布以C基因型為主，存在少量的B基因型。2河南省漯河地區(qū)的HBV血清亞型分布以ADR亞型為主，存在少量的ADW2、AYR和AYWL亞型。3HBV不同基因型的血清亞型的構(gòu)成不同。B基因型標本的血清亞型主要為ADW2，有極少量的AYWLC基因型標本的血清亞型主要為ADR，有少量的ADW2和AYR。提示HBV基因型與血清亞型存在一定的相關(guān)性。4大于30歲的B基因型感染者比C基因型感染者更有可能較早的出現(xiàn)HBEAG血清學(xué)轉(zhuǎn)換。5B基因型感染者與C基因型感染者的ALT水平?jīng)]有差別。6HBVS基因在許多位點有堿基替換現(xiàn)象，近23的位點堿基替換為錯義突變。自然人群中存在一定的HBVS基因突變，發(fā)現(xiàn)1例疫苗相關(guān)突變。核苷酸替換的平均頻數(shù)較低，提示S基因相當(dāng)保守。第二部分河南省漯河地區(qū)和黑龍江省肇東地區(qū)自然人群乙型肝炎病毒前C和C基因突變的分子流行病學(xué)初步分析目的了解河南省漯河地區(qū)和黑龍江省肇東地區(qū)自然人群慢性HBV感染者HBVBCP區(qū)T1762A1764、前C區(qū)A1896變異株的流行率；分析兩種變異株感染與HBV基因型、HBEAG抗HBE血清學(xué)狀態(tài)及疾病臨床類型間的關(guān)系；了解兩種變異株感染與ALT水平的關(guān)系。方法河南省漯河地區(qū)以第一部分254份血清中HBVS區(qū)PCR陽性者219份為研究對象。其中無癥狀HBV攜帶者124例，慢性乙型肝炎CH95例。平均年齡38歲，男性121例，女性98例。黑龍江省肇東地區(qū)2005年，以黑龍江省肇東地區(qū)雙勝村和先鋒村兩個農(nóng)村為研究現(xiàn)場，以全屯居民為研究對象，對全屯居民進行了一次橫斷面血清流行病學(xué)調(diào)查，采用固相放射免疫SPRIA法檢測HBSAG、抗HBS和抗HBC三項乙肝病毒感染指標，采用酶聯(lián)免疫ELISA法檢測HBEAG和抗HBE兩項感染指標。結(jié)合1986年這兩個現(xiàn)場的血清流行病學(xué)調(diào)查資料，綜合ALT、B超和臨床體檢等結(jié)果，按照2005年12月10日制定的慢性乙型肝炎防治指南的診斷標準，選擇可作出明確臨床診斷且HBVS區(qū)PCR陽性者97例作為研究對象。其中無癥狀HBV攜帶者78例，慢性乙型肝炎CH12例。肝硬化LC3例，肝細胞肝癌HCC1例，恢復(fù)3例。平均年齡34歲，男性52例，女性45例。對從河南省漯河地區(qū)219例研究對象和黑龍江省肇東地區(qū)97例研究對象中抽取的血清標本采用巢式PCR法擴增HBVDNA。利用QIAAMPDNABLOODMINIKIT，按照試劑盒操作說明書要求從200ΜL血清中提取HBVDNA，以其作為模板，分別設(shè)計合成2對引物擴增HBVC基因。擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，直接將PCR產(chǎn)物送TAKARA利用ABIPRISMTM3730XLDNAANALYZER測序，采用熒光標記雙脫氧終止法測定所擴增的HBVC基因。在HBVC基因的測序結(jié)果中，利用DNASTAR軟件推導(dǎo)出BCP區(qū)1762位和1764位的核苷酸序列，以及前C區(qū)1896位的核苷酸序列，與GENBANK中的HBV參考株進行比對進而確定所獲得的測序樣本中發(fā)生BCP區(qū)和前C區(qū)突變的標本。應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件SPSS130進行X2檢驗，F(xiàn)ISHER確切概率法，WILCOXON秩和檢驗對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理分析，以P＜005為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果河南省漯河地區(qū)分別有4022％和5251％慢性HBV感染者發(fā)生了HBVA1896和HBVT1762A1764變異。黑龍江省肇東地區(qū)有2857％的慢性HBV感染者分別發(fā)生了HBVA1896和HBVT1762A1764變異。結(jié)論1河南省漯河地區(qū)HBVBCP區(qū)T1762A1764雙突變的檢出率明顯高于黑龍江省肇東地區(qū)。河南省漯河地區(qū)與黑龍江省肇東地區(qū)HBVA1896突變的檢出率沒有差別。2河南省漯河地區(qū)抗HBE陽性HBV感染者發(fā)生BCP區(qū)T1762A1764雙突變和前C區(qū)A1896突變的頻率高于HBEAG陽性HBV感染者。3黑龍江省肇東地區(qū)抗HBE陽性感染者發(fā)生前C區(qū)A1896突變的頻率高于HBEAG陽性感染者4河南省漯河地區(qū)HBEAG陽性HBVBCP區(qū)T1762A1764雙突變感染者比野生型感染者有較高的ALT水平。5河南省漯河地區(qū)HBV前C區(qū)A1896突變感染者的ALT水平低于野生型感染者，抗HBE陽性前C區(qū)A1896突變感染者的ALT水平低于野生型感染者，但HBEAG陽性前C區(qū)A1896突變感染者與野生型感染者的ALT水平?jīng)]有區(qū)別。6河南省漯河地區(qū)和黑龍江省肇東地區(qū)C基因型感染者HBVBCP區(qū)T1762A1764G突變的檢出率均高于B基因型感染者，C基因型感染者和B基因型感染者前C區(qū)A1896突變的檢出率沒有差別。7河南省漯河地區(qū)CHBCP區(qū)發(fā)生T1762A1764雙突變的頻率高于。前C區(qū)發(fā)生A1896突變的頻率高于CH。8黑龍江省肇東地區(qū)發(fā)生BCP區(qū)T1762A1764雙突變的頻率和CH沒有區(qū)別CH前C區(qū)發(fā)生A1896突變的頻率高于

簡介：分類號分類號R7337學(xué)校代號學(xué)校代號10392學(xué)科專業(yè)代碼學(xué)科專業(yè)代碼100208學(xué)號號200901517福建醫(yī)科大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文慢病毒介導(dǎo)慢病毒介導(dǎo)WWOX基因過表達基因過表達對JURKAT及K562白血病細胞白血病細胞生物學(xué)特性影響生物學(xué)特性影響的實驗研究的實驗研究EFFECTSOFLENTIVIRUSMEDIATEDWWOXGENEOVEREXPRESSIONONBIOLOGICALPROPERTIESOFJURKATK562HUMANHEMATOPOIETICMALIGNANTCELLS學(xué)位類型型醫(yī)學(xué)碩士醫(yī)學(xué)碩士所在學(xué)院院醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院研究生崔兆磊崔兆磊學(xué)科、專科、專業(yè)臨床檢驗診斷學(xué)臨床檢驗診斷學(xué)導(dǎo)師林東紅林東紅教授教授胡建達胡建達教授教授研究起止日期研究起止日期2010年9月至月至2012年2月答辯日期2012年5月31日二〇一二年二〇一二年六月目錄中文摘要1英文摘要3前言6第一部分WWOX基因過表達慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定8材料與方法8實驗結(jié)果16討論21結(jié)論22第二部分慢病毒介導(dǎo)的WWOX過表達對JURKAT及K562白血病細胞生物學(xué)特性的影響23材料與方法23實驗結(jié)果29討論43結(jié)論46第三部分WWOX基因過表達誘導(dǎo)JURKAT及K562細胞凋亡的分子機制研究47材料與方法47實驗結(jié)果53討論60結(jié)論63參考文獻64綜述69致謝78

簡介：目的了解天津市源自病人的麻疹病毒野毒株的基因變異狀況及評價麻疹減毒活疫苗的免疫保護效果。方法1采集2002～2008年疑似麻疹患者的咽拭子和尿液標本用VEROSLAM細胞分離麻疹病毒；2提取病毒培養(yǎng)液中的RNA用一步RTPCR方法擴增麻疹病毒編碼核蛋白NUCLEOPROTEIN的N基因C端594個核苷酸片段擴增產(chǎn)物直接測序后與國際標準株進行生物信息學(xué)分析；3使用GENRUNER軟件篩選N基因C端594個核苷酸片段的限制性內(nèi)切酶位點確定BCNⅠ用來建立RTPCRRFLP的麻疹病毒基因分型方法以區(qū)分麻疹病毒疫苗株和中國流行的野毒株；4采用酶聯(lián)免疫吸附方法對8月齡以下嬰兒麻疹疫苗初免前的抗體水平進行分析了解保護性抗體的衰減過程；5采用酶聯(lián)免疫吸附方法和中和抗體檢測法對接種麻疹減毒活疫苗的健康人群免疫前后的抗體水平進行測定評價麻疹減毒活疫苗對流行病毒株的保護效果；6采用酶聯(lián)免疫吸附方法檢測2010年麻疹疑似病例血清特異性IGM抗體了解天津麻疹疫情變化趨勢據(jù)此評價麻疹計劃免疫和2008年麻疹強化免疫的效果。結(jié)果1采集2002～2008年天津地區(qū)散發(fā)和暴發(fā)的麻疹疑似病例標本共189份其中132份尿液中分離到57株麻疹病毒陽性分離率為4318％；采集57份咽拭子中分離到23株麻疹病毒陽性分離率為4035％2在所有分離到的80株麻疹病毒株中有11人是咽拭子和尿液同時陽性取其一做PCR和序列分析鑒定的總數(shù)為69株。69株麻疹病毒經(jīng)對N基因C端594BP的RTPCRRFLP證實均為H1基因型其中除2002年1株145％病毒為H1B基因亞型其余均為H1A9855％基因亞型未發(fā)現(xiàn)疫苗相關(guān)株A基因型表明H1A亞型為優(yōu)勢流行型；3選取24株麻疹病毒進行N基因C端450個核苷酸的種系發(fā)育分析2002～2008年流行的H1A亞型毒株的變異范圍為0002～00381～17個核苷酸差異表明天津地區(qū)流行的麻疹是由不同麻疹病毒株的多個傳播鏈引起的；4本論文建立的RTPCRRFLP方法可以區(qū)分中國麻疹病毒流行株H1A、H1B基因亞型及A基因型疫苗株與序列分析結(jié)果完全一致。該方法簡便、快速、特異、經(jīng)濟適用于大量的流行病學(xué)調(diào)查；5對922名不同年齡組健康人疫苗免疫前后的特異性IGG抗體水平比較顯示其陽性率無顯著性差異；但抗體效價的幾何平均滴度GMT方差分析提示小于8月齡、高中二年級和20～25歲三個年齡組的GMT水平較低其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；6采用中和抗體法評價13名8月齡兒童麻疹疫苗初免后IGG抗體對疫苗株和流行病毒株的保護作用兩者無顯著性差異表明當(dāng)前使用麻疹減毒活疫苗預(yù)防的有效性；7對160例8月齡以下嬰兒的麻疹保護性抗體水平進行分析新生兒麻疹I(lǐng)GG抗體陽性率僅為368％到7月齡時降至125％隨著月齡增長逐漸衰減；82010年565例疑似麻疹病例中小于8月齡組和大于14歲組共計509例9009％遠遠多于8月齡～14歲組991％。509例疑似病例實驗室確診329例陽性率高達6464％表明2008年麻疹強化免疫是有效的但現(xiàn)行麻疹疫苗的免疫程序需要進一步調(diào)整。結(jié)論1天津市流行的麻疹病毒株以H1A亞型為優(yōu)勢流行型N基因C端450個核苷酸分析顯示流行毒株間有1～17個核苷酸的差異表明存在多個不同的傳播鏈其變異屬于抗原漂移；28月齡兒童麻疹疫苗初免后產(chǎn)生的中和抗體對疫苗株和流行病毒株的保護作用無顯著性差異表明當(dāng)前使用的麻疹減毒活疫苗用來預(yù)防是有效的；38月齡以下嬰兒麻疹疫苗初免前抗體平均濃度GMC隨著月齡增長逐漸衰減易感兒增多；不同年齡組健康人群疫苗免疫前后的特異性IGG抗體效價的幾何平均滴度GMT方差分析提示小于8月齡、高中二年級和20～25歲三個年齡組的抗體水平較低結(jié)合2010年麻疹疫情反彈的流行病學(xué)分析提示現(xiàn)行的麻疹疫苗免疫程序需要進一步調(diào)整；4本研究建立的RTPCRRFLP方法能夠區(qū)分中國麻疹病毒流行株H1A、H1B基因亞型及A基因型疫苗株具有簡便、快速、特異、經(jīng)濟的優(yōu)點適用于大量的流行病學(xué)調(diào)查。

簡介：點擊查看更多18例血清學(xué)陰性乙型肝病毒相關(guān)性腎炎臨床病理特征.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：中國河南省上蔡縣等地在九十年代中期因非法采供血曾造成局部地區(qū)有償獻血人群中艾滋病病毒HIV感染流行雖然在采供血機構(gòu)整頓后經(jīng)采供血途徑造成HIV感染的流行已得到了有效的控制但已感染的有償獻血員通過性傳播和母嬰傳播途徑在配偶及嬰幼兒中造成HIV感染的二、三代傳播的情況國內(nèi)未見詳細報道該研究旨在通過血清學(xué)調(diào)查、問卷調(diào)查、縱向研究和分子流行病學(xué)研究方法對河南省上蔡縣等地兒童及其家庭開展流行病學(xué)研究以闡明當(dāng)?shù)貎和疕IV感染狀況分析流行因素及傳播特點并了解其父母HIV感染狀況、流行因素及其對艾滋病的知識、態(tài)度分析當(dāng)?shù)匕滩〔《镜膩喰头植嫉葟亩鵀橹贫A(yù)防控制策略及措施、預(yù)防及阻斷HIV母嬰傳播和性傳播提供依據(jù)控制艾滋病在當(dāng)?shù)氐倪M一步蔓延

簡介：點擊查看更多輪狀病毒NSP4基因變異與致病性改變的關(guān)系及其免疫學(xué)特性研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的調(diào)查研究寧夏地區(qū)綿羊中的BDV的自然感染狀況。對陽性檢測樣本的核苷酸序列進行連接測序，比較分析BDVP24基因序列，建立病毒株的種系發(fā)生樹，闡明其在寧夏地區(qū)綿羊中的自然感染情況及其可能的種系來源；應(yīng)用轉(zhuǎn)染的OL作進一步的病毒核蛋白的細胞內(nèi)定位研究，初步探討病毒的感染和發(fā)病機制。方法應(yīng)用巢式逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCRFQNRTPCR技術(shù)檢測中國寧夏地區(qū)綿羊腦組織和PBMC中的BDVP24和P40基因片段；對檢測BDVP24和P40基因片段均為陽性標本的P24基因片段進行連接、克隆、測序，并應(yīng)用EMBL、DNASP40和MEGA40軟件分析核苷酸和氨基酸序列同源性相似度，構(gòu)建NEIGHBJOINING基因系統(tǒng)發(fā)生樹并分析病毒感染的可能來源；對轉(zhuǎn)染的OL應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)和WESTERNBLOT的方法觀察病毒核蛋白在細胞內(nèi)的表達定位。結(jié)果在寧夏地區(qū)163只綿羊腦組織和710只綿羊的PBMC中檢測到BDVP24和P40陽性基因片段，檢出率分別為368％6163和127％9710；對15例陽性檢出標本進行連接、克隆、測序，連同14例前期檢測序列基因聚合分析顯示核酸之間的同源相似度為965％～100％，氨基酸的同源相似度為953％～100％。與德國馬源性標準株HE80同源相似度較高。構(gòu)建基因的系統(tǒng)發(fā)生樹發(fā)現(xiàn)寧夏的VE患者、抑郁癥患者、綿羊和同德國馬、綿羊、奧地利馬都各自形成了獨立的支系，其余陽性檢出序列形成混合支系，其中寧夏的VE患者、牛、綿羊同德國的馬、日本的綿羊形成了‘德國中國寧夏日本’的混合支系；在轉(zhuǎn)染BDVP40基因片段的熒光表達質(zhì)粒的OL內(nèi)激光共聚焦顯微鏡提示核蛋白存在于細胞漿和細胞膜中；WESTERNBLOT的結(jié)果顯示在細胞膜蛋白中存在核蛋白，而在細胞漿中未檢測到該蛋白。結(jié)論中國寧夏地區(qū)綿羊中可能存在BDV的自然感染；寧夏地區(qū)人和動物BDV的感染存在區(qū)域源性BDV獨立株和國外傳入基因保守株的多源性；在轉(zhuǎn)染的OL內(nèi)穩(wěn)定表達了BDV核蛋白，并將其定位在細胞的結(jié)構(gòu)蛋白中，尤其在細胞膜中含量更為豐富，推斷其可能在細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或介導(dǎo)病毒感染入胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

簡介：目的本研究是根據(jù)我省歷年來上報的乙型腦炎資料分析我省乙型腦炎的流行趨勢，并在不同生態(tài)環(huán)境中捕捉蚊蟲標本，找出我省不同生態(tài)環(huán)境中的優(yōu)勢蚊種，同時用細胞培養(yǎng)的方法從蚊體內(nèi)分離病毒，并用常規(guī)PCR和熒光PCR的方法進行初步鑒定，篩選乙型腦炎病毒，為以后對病毒進行核苷酸序列分析、鑒定病毒種類、研究我省存在的乙腦病毒與國內(nèi)、外其他地域同種病毒的差異，繪制系統(tǒng)發(fā)生樹，進而研究病毒的進化規(guī)律和分析目前使用的疫苗有無保護作用打下基礎(chǔ)。方法1資料收集根據(jù)歷年來我省上報的乙型腦炎資料進行統(tǒng)計，參考我省已發(fā)表的有關(guān)此課題的文獻，進行分析乙腦流行趨勢及其原因。2標本的收集運輸在不同生態(tài)環(huán)境中將捕到蚊子，快速凍死后剔除雄蚊，將蚊子分類，50～100只為一組，裝入凍存管中，用醫(yī)用膠布封口，并用記號筆編號，凍存管放入布袋中后及時放入液氮中，送至實驗室。3根據(jù)在我省不同生態(tài)環(huán)境中采集蚊蟲標本結(jié)果，分析我省不同生態(tài)環(huán)境中蚊種的構(gòu)成，找出優(yōu)勢蚊種。4利用BHK和VERO細胞培養(yǎng)的方法對蚊子攜帶的病毒進行分離。5用TRIZOLLSREAGENT提取分離到病毒的RNA，再用常規(guī)PCR和熒光PCR方法進行初步鑒定。結(jié)果1河南省乙型腦炎發(fā)病情況同我國總的情況基本一致。自20世紀70年代后期大規(guī)模使用乙腦疫苗后，除1990與1991年有個小發(fā)病高峰外，乙腦發(fā)病率在顯著下降，2004年發(fā)病率達到了03910萬；發(fā)病具有明顯的季節(jié)性，85％以上病例發(fā)生集中在7、8、9三個月，這與我省蚊蟲出現(xiàn)隨季節(jié)性變化而變化的特點相一致；病例主要分布于氣溫相對較高、雨量相對偏多的豫南、豫東南的信陽、駐馬店、南陽市、周口市以及商丘的部分地區(qū)，平頂山、洛陽、偶有集中發(fā)病，黃河以北地區(qū)發(fā)病相對減少。年齡分布主要集中于10歲以下兒童，占80％以上，5歲以下病例約占50％，男女性別比為14∶1。2本次實驗在我省不同生態(tài)環(huán)境中共捕獲蚊蟲25787只，其中庫蚊18999只，按蚊2715只，伊蚊85只，阿蚊3878只。庫蚊占全部蚊蟲的737％，按蚊占105％，伊蚊03％，阿蚊占15％，可見庫蚊為我省優(yōu)勢蚊種。山區(qū)、平原和濕地均以庫蚊為主，山區(qū)及濕地未能捉到伊蚊；而丘陵地區(qū)按蚊和阿蚊為優(yōu)勢蚊種，庫蚊和伊蚊較少；在黃河濕地阿蚊也占一定比例。3隨機將每個生態(tài)環(huán)境中所捕蚊子取出10管，組成一個組，研磨接種細胞，進行病毒分離。共分離到8株可疑病毒，均能引起B(yǎng)HK細胞和VERO細胞穩(wěn)定病變。BHK細胞病變以圓縮和脫落為主，而VERO細胞病變以聚集、拉網(wǎng)、圓縮為主。出現(xiàn)病變時一般在48～72小時之間，均具有濾過性022ΜM濾過膜，其中4株病毒帶回北京進行鑒定，其余4株病毒經(jīng)常規(guī)PCR及熒光PCR鑒定發(fā)現(xiàn)有一株為乙型腦炎病毒。結(jié)論河南省于1953年從病人的腦組織中分離到了乙腦病毒，1991年在河南省新安縣采集了淡色庫蚊300只、阿蚊450和三帶喙庫蚊30只，利用細胞和乳鼠對全部標本進行了病毒分離，結(jié)果從淡色庫蚊中分離出1株病毒，經(jīng)間接免疫熒光試驗、中和試驗等鑒定為乙型腦炎病毒，是河南省首次證明庫蚊是乙腦的傳播媒介，但未能對分離到的病毒進行核酸測序及鑒定。本次調(diào)查實驗再次證實庫蚊是河南省的優(yōu)勢蚊種，并且是乙型腦炎的主要傳播媒介，分離到的病毒經(jīng)常規(guī)PCR及熒光PCR等鑒定初步認為是乙型腦炎病毒，為動物實驗、病毒核苷酸測序、判斷乙型腦炎病毒的分型以及分析目前所用的乙腦減毒活疫苗對本次實驗所分離到的病毒是否有保護作用打下基礎(chǔ)。

簡介：背景抗病毒是治療慢性乙型肝炎CHB的關(guān)鍵措施干擾素IFNΑ是主要的抗病毒治療藥物之一但IFNΑ治療CHB患者的療效差異較大。因此對IFNΑ療效的影響因素及預(yù)測指標的研究尤為重要。大量研究顯示其療效受宿主因素、病毒因素及環(huán)境因素的影響宿主免疫遺傳背景的差異可能是導(dǎo)致IFNΑ治療個體化差異的重要原因之一。本研究旨在探討程序性細胞凋亡基因PD1兩個SNPS位點PD11、PD12與中國漢族CHB患者IFNΑ療效的相關(guān)性以期為個體化治療提供參考依據(jù)。方法采用前瞻性研究方法對135例初始抗病毒治療CHB患者的早期病毒學(xué)應(yīng)答情況進行評估并應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性PCRRFLP分析技術(shù)檢測患者PD11和PD12的單核苷酸多態(tài)性SNPS分別成功鑒別出AA、AG和GG三種基因型按基因型分組分析其與IFNΑ早期病毒學(xué)應(yīng)答的相關(guān)性。結(jié)果135例CHB患者IFNΑ治療獲得早期病毒學(xué)應(yīng)答為33例244％。1、PD11位點①三種基因型組間的性別Χ21105P0575、年齡F0519P0596、治療前ALT水平F0187P0829、治療前HBV病毒載量F0759P0470以及IFNΑ種類Χ20058P0971均無統(tǒng)計學(xué)差異。②早期病毒學(xué)應(yīng)答率在AA、AG和GG基因型組中分別為1430、3250和1300在AA、AG和GG基因型三組間存在差異Χ26258P0044。但早期病毒學(xué)應(yīng)答在AA和GG基因型組間無顯著性差異Χ20018P0893由于AA、GG基因型組樣本含量小而AA、GG基因型組間比較P0893故采用卡方分割法將AA基因型組、GG基因型組合并與AG基因型組進行卡方檢驗Χ26246P0012具有顯著差異所以可以認為AG基因型相對AA、GG基因型有較高的病毒學(xué)應(yīng)答率。2、PD12位點①三種基因型組間的性別Χ20518P0772、年齡F1180P0310、治療前ALT水平F1892P0155、治療前HBV病毒載量F1442P0240以及IFNΑ種類Χ20331P0848均無統(tǒng)計學(xué)差異。②早期病毒學(xué)應(yīng)答率在AA、AG和GG基因型組中分別為1820、3140和1430在AA、AG、GG基因型之間比較IFNΑ的早期病毒學(xué)應(yīng)答差異無統(tǒng)計學(xué)意義Χ23957P0138。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)PD11的SNPS可能是中國漢族CHB患者IFNΑ治療早期病毒學(xué)應(yīng)答的預(yù)測指標有待擴大樣本量后再證實。

簡介：山東大學(xué)碩士學(xué)位論文腎綜合征出血熱病毒基因序列分析與分子流行病學(xué)研究姓名宋紹霞申請學(xué)位級別碩士專業(yè)流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)指導(dǎo)教師王志玉畢振強20050512山東大學(xué)碩士掌位論文腎綜合征出血熱病毒基因序列分析與分子流行病學(xué)研究研究生宋紹霞導(dǎo)師王志玉教授畢振強主任醫(yī)師中文摘要目的從山東省嚙齒類等動物中鑒定漢坦病毒HV，陽性標本進行RTPCR擴增，測定序列，與以往山東省HV病毒株一起進行序列分析和分子流行病學(xué)研究。了解它們的同源性和遺傳距離，掌握山東省不同地區(qū)腎綜合征出血熱HFRS的分布特征，遺傳規(guī)律，進化關(guān)系；找出山東省的代表株，克隆其M基因。為從根本上預(yù)防和控制HFRS在山東省的流行打下堅實基礎(chǔ)并為研制HFRS特異診斷試劑和新型疫苗提供科學(xué)依據(jù)。，方法采集山東省不同地區(qū)的鼠肺標本，應(yīng)用間接免疫熒光法IFA鑒定出HV感染的陽性標本。根據(jù)GENBANKIIVM基因保守序列及相關(guān)參考文獻應(yīng)用PRIMER5軟件設(shè)計HTN與SEO型通用引物及將HTN型I型和SEO型II型分型的型特異性引物。通過RTPCR法擴增陽性標本中FLYM片段部分基因，測序并用DNASTAR軟件進行同源序列比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。觀察山東省IIV堿基變異情況，找出山東省的代表株，進行全M片段擴增并構(gòu)建克隆載體。測序并用BLAST軟件進行同源序列比較，觀察核苷酸以及所推導(dǎo)的氨基酸變異情況；利用SIGNALP、DNASTAR和TMPRED軟件預(yù)測其信號肽序列、疏水區(qū)、抗原區(qū)及跨膜區(qū)，分析氨基酸變異對HV包膜糖蛋白生物活性的影響。結(jié)果I捕獲2073只嚙齒目和食蟲目動物，鑒定出103份IIV感染陽性標本，陽性率為497％O2陽性標本經(jīng)RTPCR擴增，得到26份HV相應(yīng)M片段2003～2302M。3測序結(jié)果經(jīng)核苷酸序列分析表明26份HV同源性較高在973～100O％，

簡介：近年來，世界各地埃可30型腸道病毒ECHOVIRUS30，ECH030相關(guān)疾病暴發(fā)逐漸增多，我國也連續(xù)有多起暴發(fā)報道。2003年1月至7月，在我國江蘇省北部地區(qū)發(fā)生的較大規(guī)模的兒童無菌性性腦膜炎暴發(fā)流行中，本課題組從患者腦脊液中分離到了ECHO30病毒，首次明確本次感染的病原，并對該病毒的生物學(xué)特性進行了相關(guān)探討。本研究在此基礎(chǔ)上，依次建立了ECHO30國內(nèi)流行株血清特異性IGG抗體的間接免疫熒光試驗IFA和酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA檢測方法。并初步用于了解人群的ECHO30型無菌性腦膜炎隱性感染情況調(diào)查。在IFA技術(shù)建立過程中，我們使用細胞爬片法，用分離得到的毒株感染人胚肺二倍體細胞MRC5制備抗原片，優(yōu)化了IFA染色程序，確定1100和1200兩個血清稀釋度，1200的異硫氰酸熒光素FITC標記的兔抗人及抗鼠IGG稀釋度及伊文氏蘭襯染為最佳染色條件。用建立的IFA技術(shù)篩檢了71份非暴發(fā)地區(qū)兒童血清，其中得到12份為陽性，59份為陰性；47份暴發(fā)地區(qū)兒童血清中，22份為陽性，25份為陰性。研究發(fā)現(xiàn)人群中存在ECHO30型無菌性腦膜炎隱性感染者。所建立的IFA技術(shù)有較好的靈敏度，可初步用于小范圍人群的血清學(xué)檢測，但并不適用于大面積人群的血清流行病學(xué)調(diào)查。因此，本研究進一步探討了ECHO30IGG抗體的間接ELISA檢測方法。研究使用分離得到的ECHO30病毒株全病毒作為ELISA反應(yīng)體系的抗原，用棋盤滴定法確定ELISA檢測最佳條件，據(jù)陰性樣品OD值分布情況確定CUTOFF值，建立反應(yīng)體系。結(jié)果確定ELISA反應(yīng)的最佳抗原包被濃度為25ΜGML，血清檢測最佳稀釋度為1200，HRP羊抗人IGG理想稀釋度為15000，CUTOFF值定為0291。研究對ELISA檢測結(jié)果和IFA檢測結(jié)果做了比較，并以IFA為標準對ELISA的靈敏度和特異度進行了評價。結(jié)果確定ELISA檢測結(jié)果與IFA結(jié)果一致率達891％，一致性檢驗KAPPA值為0742，ELISA的靈敏度和特異度分別為818％和92％。提示兩種檢測方法在可信度上差別不大，均可用于檢測血清抗體，但根據(jù)兩種技術(shù)的操作特點，ELISA技術(shù)更適用于大面積人群的血清流行病學(xué)調(diào)杳。為了了解人群ECHO30國內(nèi)流行株引起的無菌性腦膜炎隱性感染情況及保護性分布情況，探索ECHO30病毒感染的危險因素，我們使用所建立的ELISA方法，對來自上海市不同年齡的412名健康人和來自浙江省德清縣的289名成人健康體檢者血清進行了ECHO30IGG抗體檢測，并進行了相應(yīng)比較分析。通過對上海市區(qū)人群的分析發(fā)現(xiàn)1歲以下嬰幼兒中未見抗體陽性者，15歲以下兒童抗體陽性率較低10％～167％，15歲以上人群抗體陽性率水平明顯升高450％～467％。孕婦與普通人群抗體陽性率無顯著性差異。提示上海市人群中存在隱性感染者，人群通過自然感染獲得免疫保護，15歲以下兒童為ECHO30感染及發(fā)病的高危人群，母體傳遞給嬰幼兒的抗體水平較低，不能為嬰幼兒提供先天性免疫保護。對浙江農(nóng)村人群的分析發(fā)現(xiàn)浙江農(nóng)村成人的隱性感染情況和上海人群基本相似。在這部分調(diào)查中，我們對ECHO30病毒感染的危險因素進行了單因素和多因素分析，遺憾的是，并未發(fā)現(xiàn)有顯著統(tǒng)計學(xué)意義的危險因素。目前，我國尚缺乏常規(guī)的腸道病毒監(jiān)測系統(tǒng)，ECHO30信息資料嚴重不足，我們對引起多次腦膜炎暴發(fā)的ECHO30具體傳播途徑尚不清楚。根據(jù)本研究的結(jié)果，我們推測ECHO30病毒的一般感染可能和兒童時期的特殊行為習(xí)慣有關(guān)。如果出現(xiàn)某種特別的危險因素，使ECHO30病毒有更多的機會接觸缺乏保護性抗體的兒童，就可能引起無菌性腦膜炎的暴發(fā)。因此在以后的研究中，需要進一步改善血清學(xué)調(diào)查技術(shù)，開展更大范圍的血清流行病學(xué)調(diào)查工作，結(jié)合現(xiàn)場流行病學(xué)工作和相關(guān)病毒信息，完善病毒監(jiān)測體系，繼續(xù)探索病毒在人間傳播的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，從而為疾病控制工作提供更為精確的理論指導(dǎo)。

簡介：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文人乳頭病毒16型外殼蛋白高效表達系統(tǒng)的構(gòu)建及目的蛋白的表達；HPV16型病毒蛋白血清學(xué)檢測對宮頸前病變病情監(jiān)測價值的初步探討姓名李楠申請學(xué)位級別博士專業(yè)腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師章文華200151中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士研究生論文感染，病毒僅停留于感染部位的上皮細胞內(nèi)，不產(chǎn)生病毒血癥，且病毒基因組的高水平表達及病毒顆粒的產(chǎn)生僅發(fā)生于宮頸復(fù)層鱗狀上皮表層的終末分化細胞，與免疫系統(tǒng)不能充分接觸，機體的免疫應(yīng)答輕微；HPV難以在體外培養(yǎng)，目前尚不能在實驗條件下產(chǎn)生足夠用于血清學(xué)分析抗原制備的乳頭瘤病毒，而病變組織中病毒顆粒的含量又很低。雖然大量的工作已部分地克服了以上困難，但血清學(xué)方法用于宮頸癌及C1N病情監(jiān)測的研究結(jié)論卻不甚一致。本文以HPVL6為例就研究現(xiàn)狀進行綜述。1．抗原來源1．1人工合成的病毒蛋白的多肽【8，91。這方面研究較多的是HPVL6的E6、E7和LL蛋白。一些實驗室分別合成了一系列氨基酸序列首尾重疊的短肽，覆蓋蛋白的全序列，以其免疫動物獲得抗血清，用基因工程表達的完整蛋白包被ELISA板或轉(zhuǎn)移于纖維素膜上檢測抗血清，或用完整蛋白免疫動物取得的抗血清檢測系列短肽，由此確定該蛋白的B細胞表位，再以確定含有特定表位的肽或直接以系列短肽檢測人血清，確定某些抗體與疾病的相關(guān)性。然而，覆蓋全長的多個短肽仍有可能無法檢出僅存在于完整蛋白序列中的表位，且合成肽成本較高?1。1．2以基因重組技術(shù)用細菌表達的融合或非融合蛋白【IOQ21。這種方法得到的蛋白序列比較完整。由于原核表達產(chǎn)量高，操作簡便，成本低，產(chǎn)品易于純化，在HPV病毒蛋白，尤其是對晚期蛋白研究的早期，融合蛋白的研究較廣泛，學(xué)者們利用細菌表達的蛋白做WESTERNBLOT，以及利用純化的蛋白做ELISA進行血清學(xué)研究，但許多實驗室研究結(jié)果差異較大，主要原因是表達的病毒蛋白的氨基酸序列完整性不同；攜帶的菌體蛋白可能與人體內(nèi)的細菌抗體產(chǎn)生非特異反應(yīng)融合蛋白多以包涵體形式獲得，使用時為變性蛋白形式，影響了病毒蛋白構(gòu)象表位的形成。1．3體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的病毒蛋白113,15,49。這種蛋白接近病毒蛋白的天然構(gòu)

簡介：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文尖銳濕疣病變的人乳頭瘤病毒分子流行病學(xué)研究及L1序列多態(tài)性分析和在原核表達體系中的表達姓名洪少林申請學(xué)位級別博士專業(yè)皮膚性病學(xué)指導(dǎo)教師王家璧曾毅200211中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士論文PAGEPBSPCRPVRFLPSDSTAETBS．TTETEⅧDTNFVLPX。堅ALPOLYACRYLAMIDEGELELECTROPHORESIS聚丙烯酰胺凝膠電泳PHOSPHATEBUFFEREDSALINE磷酸鹽緩沖液POLYMERASECHAINREACTION聚合酶鏈式反應(yīng)PALIILLOMAVIRUS乳頭瘤病毒RESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM限制性片段長度多態(tài)性SODIUMDODECYLSULFATE十二烷基磺酸鈉TRISACETICEDTABUFFERTAE緩沖液TRISBUFFEREDSALINE．TWEEN吐溫TRIS鹽緩沖液TRISEDTABUFFERTE緩沖液N，N，N’，NTETRAMETHYLETHLENEDIAMINE四甲基乙二胺TUMORNECROSISFACTOR腫瘤壞死因子VINLSLIKEPARTICLE病毒樣顆粒5BROMO一4一CHLORA一3一INDOLYLBDGALACTOSIDE5一溴4M氯一3一嗚哚一BD半乳糖苷北京協(xié)和醫(yī)院2

簡介：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文EB病毒與T細胞淋巴瘤關(guān)系的研究①分子流行病學(xué)研究②EB病毒誘發(fā)T細胞淋巴瘤的實驗研究③T細胞淋巴瘤體外細胞系的建立姓名黃燕萍申請學(xué)位級別博士專業(yè)病理與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師何祖根曾毅200151巾C目醫(yī)學(xué)豐學(xué)院、協(xié)和醫(yī)科凡4I礴侖艾616％，外用T細胞淋巴瘤的檢出率為698％。結(jié)外淋巴瘤的檢出率高1。結(jié)內(nèi)淋巴瘸PN∞≯結(jié)果提示，外周T細胞淋巴瘤與EB病毒有關(guān)，尤其是外周T細胞淋巴瘤中的J打L管中心性T細胞淋巴瘤、血管免疫母T細胞淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤。二、EB病毒誘導(dǎo)胸腺惡性T細胞淋巴瘤的實驗研究，為研究EB病毒在惡性T細胞淋巴瘤發(fā)生中的作用。F將EB病毒感＼染的人胚胸腺細胞移植于SCID鼠皮下，于移植后第3同起在移植處剝‘側(cè)皮下注射TPA12一OTETRADECANOYLPHORBOL13ACETATE，TPA佛波醇二酯50NG／只，每周一次。實驗設(shè)對照組為正常胸腺細胞TPA5只鼠，實驗組為胸腺細胞EBV組4只鼠，和胸腺細胞EBVTPA組13只鼠。于移植后第4周起，移植處皮下有結(jié)節(jié)狀隆起形成，并逐漸增大。丁6～15周內(nèi)行病理檢查和免疫組織化學(xué)染色，證實為T細胞淋巴瘤8例，其中腳腺細胞EBV組的成瘤率為25％1／4，胸腺細胞EBVTPA組的成瘤率為538％7／13，對照組胸腺細胞TPA的成瘤率為O％0／5。PCR和原位雜交在誘導(dǎo)腫瘤中可檢測到EB病毒的基因EBERS、LMPL和BARFL，并有病毒基因LMPI蛋白編碼產(chǎn)物的表達。VF刃結(jié)果提示EB病毒可感染人胚胸腺細胞，并使其發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，EB病毒可能是惡性T細胞淋巴瘤發(fā)生的病因之一。