簡(jiǎn)介：該研究旨在建立一種檢測(cè)不同動(dòng)物HEV抗體的ELISA方法調(diào)查不同動(dòng)物對(duì)HEV的易感性探討HEV抗體對(duì)不同重組抗原的反應(yīng)性主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下一、動(dòng)物HEVF2基因的克隆和表達(dá)用逆轉(zhuǎn)錄巢式PCRRTPCR擴(kuò)增HEV新西蘭豬病毒株NZSF2的部分基因片段并克隆到PGEX4T2載體上用雙酶切和測(cè)序的方法進(jìn)行鑒定然后用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109IPTG誘導(dǎo)表達(dá)P166NZS親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物并用PAGE電泳進(jìn)行鑒定雙酶切鑒定和測(cè)序的結(jié)果說明目的基因正確連接到載體上電泳結(jié)果證實(shí)P166NZS成功表達(dá)而且所表達(dá)的重組蛋白純度高二、用多基因型的HEV重組蛋白建立雙抗原夾心法ELISADSELISA用P166MIX和HRP標(biāo)記的P166MIX建立DSELISA用DSELISA檢測(cè)3只實(shí)驗(yàn)感染HEV的靈長(zhǎng)類動(dòng)物系列血清結(jié)果顯示3只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染HEV之前和感染后短時(shí)間內(nèi)HEV抗體陰性23月后陽(yáng)轉(zhuǎn)說明新建立的DSELISA方法可以用于感染不同基因型HEV的不同動(dòng)物血清HEV抗體的檢測(cè)三、與人類生活關(guān)系密切的7種動(dòng)物血清HEV抗體和HEVRNA的檢測(cè)用血清學(xué)和PCR方法研究與人類生活關(guān)系密切的7種動(dòng)物對(duì)HEV的易感性結(jié)果發(fā)現(xiàn)在豬、家犬和寵物狗血清標(biāo)本中存在HEV抗體警犬、山羊、雞、鴨、鴿子和兔血清標(biāo)本中未檢測(cè)到HEV抗體犬血清標(biāo)本用RTNPCR未擴(kuò)增出HEVRNA表明用多基因型HEV重組蛋白建立的雙抗原夾心法ELISA適用于多種動(dòng)物血清標(biāo)本HEV抗體的檢測(cè)豬和犬對(duì)HEV易感在HEV傳播中可能起重要作用四、人和動(dòng)物血清抗HEV抗體血清學(xué)關(guān)系的研究將代表四種基因型的HEV重組蛋白分別包被酶標(biāo)板對(duì)實(shí)驗(yàn)感染HEV的靈長(zhǎng)類動(dòng)物血清以及部分HEV抗體陽(yáng)性的人和動(dòng)物血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分析人和動(dòng)物血清HEV抗體對(duì)不同HEV重組蛋白反應(yīng)性的差異結(jié)果顯示用與所感染HEV病毒株相同基因型的重組蛋白檢測(cè)效果最好P166PAK對(duì)部分感染第Ⅳ基因型HEV病毒株的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清缺乏反應(yīng)性大部分病人和動(dòng)物血清標(biāo)本用P166NZS和P166CHI檢測(cè)效果較好部分標(biāo)本對(duì)P166PAK和P166MEX反應(yīng)性較差提示人和動(dòng)物HEV抗原性存在交叉但與基因型有關(guān)人HEV第1基因型重組蛋白會(huì)對(duì)部分感染HEV第Ⅳ基因型病毒株的個(gè)體所產(chǎn)生的抗體缺乏反應(yīng)性我們的研究結(jié)果表明用人和動(dòng)物的多基因型和亞型的HEV重組蛋白建立的檢測(cè)HEV抗體的雙抗原夾心法ELISA適用于感染不同基因型HEV病毒株的不同動(dòng)物血清HEV抗體的檢測(cè)豬和犬對(duì)HEV易感它們?cè)贖EV傳播過程中可能起了重要作用HEV抗體對(duì)不同基因型HEV重組蛋白的反應(yīng)性有差別用與所感染的HEV病毒株屬于同一個(gè)基因型的重組蛋白作為檢測(cè)抗原最佳第Ⅰ基因型重組蛋白對(duì)部分第Ⅳ基因型HEV病毒株感染所產(chǎn)生的抗體缺乏反應(yīng)性單用第Ⅰ基因型重組蛋白作為檢測(cè)抗原容易造成漏診多基因型HEV重組蛋白混合物是HEVELISA診斷檢測(cè)抗原的最佳候選

簡(jiǎn)介：病毒性肝炎是我國(guó)的常見、多發(fā)病，其中乙型肝炎病毒HBV慢性感染是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的主要危險(xiǎn)因子之一。乙型肝炎病毒變異性高，其基因組包括四個(gè)開放閱讀框C、P、S、X，其中HBX編碼的蛋白是一種多功能性蛋白，為病毒基因組轉(zhuǎn)錄所必需，在乙型肝炎病毒的復(fù)制、細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA修復(fù)及凋亡過程中起重要作用。因此，對(duì)HBX進(jìn)行深入研究具有極其重要的理論和臨床意義。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫應(yīng)答的核心成分，通過受體與帶有CTL表位即抗原肽的MHCI類分子互相作用，溶解、殺傷靶細(xì)胞?？乖氖强乖心鼙幻庖呒?xì)胞特異性識(shí)別的線性片段或空間構(gòu)象性結(jié)構(gòu)，是引起免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)的基本單位，在機(jī)體免疫中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，抗原表位的選擇也是能否獲得特異性抗體的關(guān)鍵。由于HBX表位可以被不同的MHCI類分子所識(shí)別、遞呈，在這些MHCI類分子中，中國(guó)人群中HLAA2陽(yáng)性的人群高達(dá)50％，因此對(duì)HLAA0201限制性的CTL表位進(jìn)行研究具有更大的現(xiàn)實(shí)意義。迄今為止，HBV被分為八個(gè)不同的基因型AH，以及眾多的血清型。我們選擇了中國(guó)人群中最常見B基因型中的ADW血清型和C基因型中的ADR血清型的基因序列作為研究對(duì)象，分別通過三個(gè)提供表位預(yù)測(cè)服務(wù)的網(wǎng)絡(luò)站點(diǎn)，以及超基序、延展基序和量化基序等方案預(yù)測(cè)獲得4條九肽作為候選表位HBXVLCLRPVGA、HBX2CLFKDWEEL、HBX3VLHKRTLGL、HBX4HLSLRGLPV。由于預(yù)測(cè)結(jié)合并不等于實(shí)際結(jié)合，并且實(shí)際結(jié)合也并不意味著真正具有免疫原性，所以有必要通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)表位的結(jié)合能力、免疫原性進(jìn)行進(jìn)一步的免疫學(xué)鑒定。為此，我們根據(jù)文獻(xiàn)分別選擇了陽(yáng)性肽HBCFLPSDFFPSI以及陰性肽HBC，HLAA2402EYLVSFGVW作為陽(yáng)性、陰性參照。T2細(xì)胞作為一種免疫學(xué)研究的工具，其表面空載的HLAA0201分子表達(dá)極不穩(wěn)定，而外源性抗原肽的結(jié)合能夠提高HLAA0201分子的穩(wěn)定性，因此我們通過T2細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)和結(jié)合穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各候選表位與HLAA0201分子結(jié)合的親和力、穩(wěn)定性，四條候選表位中HBX2的親和力和穩(wěn)定性最高。為了進(jìn)一步檢測(cè)各候選表位在體內(nèi)環(huán)境中的免疫原性，我們以HLAA21K轉(zhuǎn)基因鼠為模型，模擬體內(nèi)環(huán)境，對(duì)四條候選表位刺激脾細(xì)胞釋放IFNΓ的能力和誘導(dǎo)的肽特異性CTL的細(xì)胞殺傷能力進(jìn)行了檢測(cè)，四條候選表位中HBX2同樣表現(xiàn)出較高的刺激脾細(xì)胞釋放IFNΓ和誘導(dǎo)的肽特異性CTL的細(xì)胞殺傷的能力。之后我們分離了HLAA0201陽(yáng)性慢性活動(dòng)期乙肝病人外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，通過檢測(cè)HBX2和各對(duì)照肽體外刺激單個(gè)核細(xì)胞分泌IFNΓ的能力和誘導(dǎo)的肽特異性CTL的細(xì)胞殺傷能力，對(duì)HBX2的免疫原性作進(jìn)一步的鑒定。根據(jù)體內(nèi)、體外鑒定的結(jié)果，我們利用HBX2構(gòu)建了可溶性的肽四聚體，為將該表位進(jìn)一步應(yīng)用于臨床診斷和治療鋪平了道路。綜上所述，HBX2CLFKDWEEL是一個(gè)潛在的HBX來源的HLAA0201限制性CTL表位，具備應(yīng)用于臨床診斷、治療的可能性。我們的研究為進(jìn)一步深入探討HBX在乙肝和乙肝導(dǎo)致的肝細(xì)胞癌中的作用以及慢性乙肝、肝細(xì)胞癌的診斷、治療研究打下了良好的基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：背景及目的非酒精性脂肪性肝?。∟ONALCOHOLICFATTYLIVERDISEASENAFLD）是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)，包括單純性脂肪肝（SIMPLESTEATOSIS），非酒精性脂肪性肝炎（NONALCOHOLICSTEATOHEPATITIS，NASH），以及NASH相關(guān)的肝纖維化肝硬化、肝癌。隨著生活水平的提高，NAFLD在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率顯著上升，我國(guó)NAFLD患者數(shù)量在過去的10年增加了近一倍，部分地區(qū)的發(fā)病率已達(dá)四分之一。同時(shí)，我國(guó)是病毒性肝炎感染的高發(fā)地區(qū)，約有1億HBV感染者及4000萬(wàn)HCV感染者，其中合并NAFLD的患者有逐年增加的趨勢(shì)，這一部分人群已經(jīng)引起了研究者們的注意。目前關(guān)于NAFLD合并病毒性肝炎的研究多集中在NAFLD合并慢性丙型肝炎CHRONICHEPATITISCCHCNAFLD可以增加CHC患者進(jìn)展為肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌HEPATOCELLULARCARCINOMAHCC的風(fēng)險(xiǎn)，并降低抗病毒治療的療效。但是，丙型肝炎病毒HEPATITISCVIRUSHCV本身具有致肝細(xì)胞脂肪變的作用，因此在NAFLD合并CHC患者中得到的結(jié)論可能并不能推而廣之。關(guān)于NAFLD對(duì)慢性乙型肝炎CHRONICHEPATITISBCHB的影響，目前的研究結(jié)果卻并不一致，與CHC中看到的現(xiàn)象也不相同。部分研究認(rèn)為，肝臟脂肪變對(duì)CHB具有保護(hù)作用在脂肪肝患者中，乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUSHBV載量更低，乙肝病毒表面抗原HEPATITISBSURFACEANTIGENHBSAG清除率更高。但另一方面，一些研究顯示，脂肪肝可能會(huì)增加CHB患者發(fā)展為肝硬化及HCC的風(fēng)險(xiǎn)，降低恩替卡韋抗病毒治療的效果。還有一些研究認(rèn)為，脂肪肝對(duì)HBV病毒載量及干擾素抗病毒治療無影響。事實(shí)上，這方面的研究存在許多難點(diǎn)，可能是導(dǎo)致這些矛盾結(jié)論的原因。首先，研究中多用肝臟超聲診斷脂肪肝。肝臟超聲檢查僅能檢出肝內(nèi)脂肪沉積超過30％的中度脂肪肝，難以檢出輕度脂肪肝（肝臟內(nèi)脂肪沉積為5％30％），因此在分組時(shí)，可能將輕度脂肪肝患者作為無脂肪肝的對(duì)照。其次，在研究NAFLD合并CHB時(shí)，難以保證受試者在代謝、病毒、治療等多種因素上的一致性。第三，人群研究難以獲取肝組織觀察肝內(nèi)免疫、代謝等方面的改變。因此，NAFLD在慢性病毒性肝炎中的影響仍不明確。動(dòng)物模型可以克服上述臨床研究中的不足，但目前尚缺乏NAFLD合并病毒性肝炎的動(dòng)物模型。為了更好的研究NAFLD對(duì)慢性病毒性肝炎的影響，本研究的具體研究目標(biāo)如下1成功建立飲食誘導(dǎo)的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型；2在飲食誘導(dǎo)的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型中，動(dòng)態(tài)觀察肝炎病毒的復(fù)制情況及肝組織損傷程度；3探討NAFLD影響病毒性肝炎病程的相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制。方法1采用60％高脂飲食（HIGHFATTYDIETHFD）喂養(yǎng)C3HHEN小鼠12周，觀察小鼠一般狀態(tài)及生活習(xí)性改變，觀察體重、谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALANINEAMINOTRANSFERASEALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶（ASPARTATEAMINOTRANSFERASEAST）、甘油三酯TRIGLYCERIDETG、總膽固醇TOTALCHOLESTEROLTC、高密度脂蛋白HIGHDENSITYLIPOPROTEINHDL、低密度脂蛋白（LOWDENSITYLIPOPROTEINLDL、血糖（GLUCOSEGLU）、胰島素水平及穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)（HOMEOSTASISMODELASSESSMENTINSULINRESISTANCEHOMAIR）的動(dòng)態(tài)變化及肝臟組織學(xué)變化。23型鼠肝炎病毒（MURINEHEPATITISVIRUS3MHV3）腹腔注射感染NAFLD小鼠，觀察小鼠一般狀態(tài)及生存率；動(dòng)態(tài)觀察小鼠感染后血清生化學(xué)變化及肝臟病理改變；逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)（REVERSETRANIONPOLYMERASECHAINREACTIONRTPCR）檢測(cè)小鼠肝內(nèi)MHV3。3MHV3腹腔感染NAFLD小鼠及正常飲食（NMALDIETND）小鼠，比較兩組小鼠生存率；比較兩組小鼠各時(shí)間點(diǎn)血清生化學(xué)變化及肝組織病理改變；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)REALTIMEPOLYMERASECHAINREACTIONREALTIMEPCR檢測(cè)并比較各時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠肝內(nèi)MHV3復(fù)制情況。4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MHV3感染后各時(shí)間點(diǎn)小鼠肝內(nèi)CD3CD8CD69T細(xì)胞、CD3CD8PD1T細(xì)胞、CD4CD25FOXP3TREG細(xì)胞比例的變化，并比較兩組小鼠之間的差異；REALTIMEPCR檢測(cè)并比較兩組小鼠MHV3感染后各時(shí)間點(diǎn)肝內(nèi)IL1Β、IL6、IL10、IL17A、IL22、IL33、TNFΑ、FGL2的表達(dá)，并比較兩組小鼠之間的差異。結(jié)果1成功建立NAFLD小鼠模型。HFD飲食喂養(yǎng)12周，C3HHEN小鼠體型肥胖，皮毛油膩，不喜活動(dòng)，體重明顯增加；外周血ALT及AST水平無顯著升高；TG、TC、HDL、LDL、GLU、胰島素水平及HOMAIR均顯著升高；小鼠肝臟體積增大，肝重高于ND組，邊緣圓鈍，色澤紅黃，表面光滑，有油膩感；肝組織切片HE染色及油紅O染色可見肝細(xì)胞內(nèi)大量脂滴形成。2成功建立飲食誘導(dǎo)的NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型。NAFLD小鼠感染MHV3病毒后，在312天內(nèi)出現(xiàn)死亡，死亡率約為20％；感染小鼠外周血ALT和AST水平顯著升高；感染小鼠肝臟蒼白，缺乏光澤，并可見彌漫分布的針尖樣出血點(diǎn)；HE染色除可見肝細(xì)胞內(nèi)脂滴形成，還可見肝細(xì)胞胞漿疏松、肝細(xì)胞壞死、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等表現(xiàn)；PCR可檢測(cè)到肝內(nèi)MHV3病毒復(fù)制。3NAFLD小鼠感染MHV3病毒后，生存率與對(duì)照組無差異；MHV3病毒復(fù)制高于對(duì)照組，于感染4天時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0002）；ALT及AST升高幅度大于ND組；肝組織炎癥壞死程度交對(duì)照組嚴(yán)重。4NAFLD小鼠感染MHV3病毒后，肝內(nèi)IL1Β、IL6、IL10、IL17A、IL33、TNFΑ、FGL2表達(dá)水平上調(diào)，且上調(diào)幅度大于ND組小鼠，而IL22表達(dá)水平降低，且降低幅度大于對(duì)照組小鼠。5NAFLD小鼠感染MHV3病毒后，肝內(nèi)CD4CD25FOXP3TREG細(xì)胞比例降低，但感染第16天開始高于ND組小鼠；CD3CD8CD69T及CD3CD8PD1T細(xì)胞均出現(xiàn)升高，上升幅度大于ND組小鼠，且細(xì)胞比例回落后仍持續(xù)高于ND組小鼠。結(jié)論1本研究采用HFD喂養(yǎng)C3HHEN小鼠12周成功建立NAFLD小鼠模型，并在此基礎(chǔ)上采用MHV3病毒腹腔感染小鼠，成功建立NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型。為研究NAFLD對(duì)病毒性肝炎的影響提供了動(dòng)物模型，開辟了新的研究途徑。2NAFLD可以加劇肝內(nèi)MHV3病毒復(fù)制，加重肝內(nèi)炎癥反應(yīng)。3NAFLD在病毒性肝炎感染早期可以促進(jìn)肝內(nèi)細(xì)胞因子的釋放，使CD3CD8CD69T比例增加，CD4CD25FOXP3TREG比例降低，可導(dǎo)致肝內(nèi)炎癥壞死加重的。而感染后期CD4CD25FOXP3TREG及CD3CD8PD1T細(xì)胞比例的增加，有可能阻礙病毒清除。

簡(jiǎn)介：目的分析乙肝病毒HEPATITISBVIRUS，HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)RTI233V變異的演變規(guī)律及其與阿德福韋酯ADV耐藥的相關(guān)性。方法分析了9830例慢性HBV感染者血清樣本中HBVRTI233V變異的檢出率。選擇其中2例代表性患者的動(dòng)態(tài)收集血清樣本，擴(kuò)增HBVRT基因并克隆測(cè)序（＞20個(gè)克隆樣本）以觀察RTI233V變異的演變過程。構(gòu)建PTRIEXHBV11倍野生株WT、3種臨床變異株RTI233V、RTN236T、RTI233VRTN236T和定點(diǎn)回復(fù)突變株RTN236T復(fù)制子，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入HEPG2肝癌細(xì)胞，分別加入不同濃度梯度或最高濃度的拉米夫定LAM、阿德福韋酯ADV、恩替卡韋ETV和替諾福韋TDF作用，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)不同藥物濃度作用后細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBVDNA水平，分析變異病毒復(fù)制力與表型耐藥變化特點(diǎn)。結(jié)果9830例慢乙肝患者血清樣本中共檢出RTI233V位點(diǎn)變異28例，檢出率為028％，其中RTI233V單獨(dú)變異19例，與RTN236T等經(jīng)典耐藥變異聯(lián)合出現(xiàn)9例。該變異的檢出患者均有ADV治療史，其中16例571％接受ADV單藥治療6個(gè)月以上，12例429％接受包括ADV的多藥序貫聯(lián)合治療1年以上?；颊?相對(duì)病毒復(fù)制力與表型耐藥分析顯示，RTI233V變異株的復(fù)制力與野生株接近982％，RTN236T變異株則較野生株顯著降低554％RTI233VRTN236T變異株的相對(duì)病毒復(fù)制力為野生株的1004％，表明RTI233V變異可明顯恢復(fù)RTN236T變異株受損的復(fù)制力RTN236T、RTI233VRTN236T和RTI233V變異株對(duì)ADV的敏感性分別為野生株的1682，1528和1157，RTN236T和RTI233VRTN236T變異株對(duì)ADV耐藥，而RTI233V變異株對(duì)ADV仍然敏感，與RTN236T聯(lián)合變異對(duì)ADV耐藥性的影響不大。患者2RTI233V變異株的相對(duì)病毒復(fù)制力為野生株的1025％對(duì)ADV的敏感性為野生株的1076。RTI233V變異株對(duì)ADV及LAM、ETV和TDF均敏感。ADV對(duì)臨床變異株RTI233VRTN236T和定點(diǎn)回復(fù)突變株RTN236TLAB的抑制率相似，進(jìn)一步證實(shí)RTI233V變異株對(duì)ADV耐藥性影響不大。結(jié)論RTI233V位點(diǎn)變異與ADV應(yīng)答不佳相關(guān)，但不直接降低病毒對(duì)ADV的敏感程度，可以恢復(fù)經(jīng)典ADV耐藥病毒株的復(fù)制力，是一種復(fù)制力補(bǔ)償變異。

簡(jiǎn)介：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文慢性活動(dòng)性EPSTEINBARR病毒感染患兒的臨床診斷方法及免疫學(xué)機(jī)制的研究姓名邢燕申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)兒科指導(dǎo)教師魏珉宋紅梅20080630中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士研究生學(xué)位論文AEBV血液學(xué)方面的診斷包括外周血白細(xì)胞升高且以淋巴細(xì)胞升高為主、異型淋巴細(xì)胞10％，而進(jìn)一步淋巴亞群分析往往提示這些增多的細(xì)胞為CD38DRCD8的T淋巴細(xì)胞。而CAEBV在血液學(xué)和淋巴亞群方面是否有可以協(xié)助CAEBV臨床診斷的、不同于AEBV和正常兒童的特點(diǎn)，至今還沒有這方面的報(bào)道。外周血單個(gè)核細(xì)胞PERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLS，PBMC總DNA水平一樣的患兒不等于EBV在各種淋巴細(xì)胞的感染程度和引起的免疫細(xì)胞應(yīng)答一樣，有報(bào)道EBV感染T細(xì)胞為主型與CAEBV的高死亡率呈正相關(guān)性，需要早行骨髓移植等的更積極的治療方案。國(guó)內(nèi)常規(guī)的檢測(cè)外周血EBVODNA的方法不能區(qū)分EBV感染的淋巴細(xì)胞種類，進(jìn)而不能明確CAEBV患兒EBV更具體的感染情況，因此明確CAEBV的感染細(xì)胞類型，幫助A垣BV的臨床分型診斷，可能對(duì)更深入的研究其病毒學(xué)發(fā)病機(jī)制、指導(dǎo)個(gè)體化診治及判定預(yù)后有重要意義。關(guān)于CAEBV的發(fā)病機(jī)制方面，病毒抗原自身和宿主兩方面的因素導(dǎo)致EBV免疫逃逸的機(jī)制在CAEBV的發(fā)病過程中可能起了重要作用。宿主針對(duì)EBV的正常免疫應(yīng)答包括固有免疫和獲得性又稱適應(yīng)性免疫。國(guó)外研究顯示，宿主的適應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答特別是EBV特異的CD4T細(xì)胞應(yīng)答和CD8T細(xì)胞應(yīng)答對(duì)EBV的清除和疾病的轉(zhuǎn)歸有著重要意義，而CAEBV患兒存在細(xì)胞免疫功能紊亂與其病情慢性活動(dòng)性相關(guān)。但目前的研究大多局限于針對(duì)CAEBV患兒CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞和NK細(xì)胞的變化進(jìn)行分析，尚沒有CAEBV的T細(xì)胞功能亞群、調(diào)節(jié)亞群、初始又稱純真記憶亞群和激活亞群的研究。CAEBV時(shí)宿主針對(duì)EBV特異的適應(yīng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答方面，目前CAEBV的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，國(guó)外研究顯示，EBV特異的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞CYTOXICTLYMPHOCYTE，CTL數(shù)目的減少可能是EBV免疫逃逸的重要機(jī)制之一。然而，EBVCTL的數(shù)目并不完全代表宿主針對(duì)EBV特異的適應(yīng)性細(xì)胞免疫的功能，尤其是EBVCTL功能的真實(shí)狀況，目前CAEBV感染尚沒有針對(duì)EBV肽段庫(kù)方面的CD8的EBV特異CTL功能方面的研究。2

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簡(jiǎn)介：目的我國(guó)是病毒性肝炎大國(guó)，一般人群已成為乙型肝炎、丙型肝炎防治工作的重點(diǎn)，國(guó)產(chǎn)酶標(biāo)試劑血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果并不能反映人群全部感染情況，一些乙型肝炎表面抗原HBSAG陰性的乙型肝炎病毒HBV感染以及急性HBV、丙型肝炎病毒HCV窗口期感染可以通過核酸檢測(cè)技術(shù)NAT加以確認(rèn)，對(duì)一般人群進(jìn)行血液HBV、HCV病毒標(biāo)志物血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)，既可為完善病毒性肝炎防治措施提供有價(jià)值的人群陽(yáng)性率信息，又可為當(dāng)?shù)孬I(xiàn)血人群的篩查改進(jìn)研究提供流行病學(xué)參考依據(jù)，提高輸血安全。我們研究包括三個(gè)方面1采用血清學(xué)方法，對(duì)江蘇省部分地區(qū)一般人群乙肝、丙肝病毒標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，了解HBSAG陰性人群乙肝血清標(biāo)志物構(gòu)成模式，分析病毒核酸檢測(cè)的必要性。2采用核酸檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)混合血清乙型肝炎病毒核酸HBVDNA、丙型肝炎病毒核酸HCVRNA。3研究混合檢驗(yàn)法總體率可信區(qū)間估計(jì)方法，并估計(jì)江蘇省部分地區(qū)一般人群HBVDNA、HCVRNA陽(yáng)性率可信區(qū)間。研究萬(wàn)法1按照分層整群隨機(jī)抽樣方法，對(duì)在金壇市、海門市、海安縣、贛榆縣抽取的一般人群進(jìn)行HBSAG、乙型肝炎表面抗體HBSAB、乙型肝炎核心抗體HBCAB、丙型肝炎抗體HCVAB檢測(cè)。分析不同地區(qū)、不同年齡HBSAG陰性一般人群乙肝血清標(biāo)志物不同模式構(gòu)成。2依據(jù)一般人群血清學(xué)模式構(gòu)成情況，對(duì)HBSAG陰性不同血清學(xué)模式的標(biāo)本按12人份進(jìn)行混合，提取乙肝、丙肝病毒核酸，并采用熒光定量聚合酶鏈檢測(cè)技術(shù)RTPCR進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用混合血清總體率可信區(qū)間估計(jì)方法計(jì)算一般人群HBVDNA、HCVRNA檢出率。3選取HBVDNA、HCVRNA陽(yáng)性混合組進(jìn)行拆分檢測(cè)，采用熒光定量PCR檢測(cè)單份血清病毒核酸。4對(duì)HCVAB酶聯(lián)免疫檢測(cè)法ELISA初檢陽(yáng)性，HBSAGELISA法復(fù)檢陽(yáng)性血清標(biāo)本提取病毒核酸，用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。5在分析國(guó)外SACKS氏方法及KLINE氏方法基礎(chǔ)上，運(yùn)用校正一次近似法計(jì)算混合檢驗(yàn)法總體率可信區(qū)間，并與精確概率法計(jì)算結(jié)果進(jìn)行比較。研究結(jié)果1江蘇省一般人群HCVAB總陽(yáng)性率為076％，蘇南地區(qū)的HCVAB陽(yáng)性率明顯高于蘇中、蘇北地區(qū)。江蘇省一般人群的HBSAG總陽(yáng)性率為484％，蘇中和蘇南地區(qū)的HBSAG陽(yáng)性率高于蘇北地區(qū)。在HBSAG陰性人群中，蘇中地區(qū)以單項(xiàng)HBCAB，以及HBSAB伴HBCAB的構(gòu)成居多，明顯高于蘇南、蘇北地區(qū)。2對(duì)蘇南、蘇中地區(qū)HBSAG陰性人群檢測(cè)HBVDNA的結(jié)果表明，兩個(gè)地區(qū)HBSAG陰性人群HBVDNA總檢出率為153％95％CI098％，234％，其中蘇中地區(qū)HBVDNA檢出率為195％95％CI111％，315％，蘇南地區(qū)HBVDNA檢出率為091％9506CI029％，211％。在蘇中地區(qū)HBSAG陰性人群中，HBVDNA陽(yáng)性結(jié)果主要集中在單項(xiàng)HBCAB，以及HBSAB伴HBCAB者中。另外，蘇南地區(qū)30份HBSAG復(fù)檢陽(yáng)性的血清中有11份HBVDNA檢測(cè)陽(yáng)性。3江蘇省HBSAG陰性人群HCVRNA陽(yáng)性率為051％，95％CI是023％，098％；其中，蘇南地區(qū)HCVRNA陽(yáng)性率最高，為147％95％CI06％，29％，蘇北地區(qū)較低，為03％95％CI00075％，17％，蘇中地區(qū)沒有檢出HCVRNA陽(yáng)性標(biāo)本。另外，所有HCVAB初檢陽(yáng)性、復(fù)檢陰性的血清HCVRNA均檢測(cè)陰性，27份HCVAB復(fù)檢陽(yáng)性的血清有11份HCVRNA檢測(cè)陽(yáng)性。4我們提出的總體率可信區(qū)間估計(jì)方法與國(guó)外的SACKS氏方法及KLINE氏方法進(jìn)行比較，在陽(yáng)性率不太低時(shí)，幾種方法差別不大，而當(dāng)陽(yáng)性率較低時(shí)，校正一次近似法計(jì)算結(jié)果與精確概率法相近，可以得出較理想的非負(fù)下限值。結(jié)論1江蘇省蘇中和蘇南地區(qū)一般人群HBSAG陽(yáng)性率高于蘇北地區(qū)。蘇中地區(qū)HBSAG陰性一般人群中，單項(xiàng)抗HBC，以及抗HBC伴抗HBS的構(gòu)成比高于蘇南、蘇北地區(qū)。2HBSAG陰性人群中HBVDNA檢出率蘇中高于蘇南地區(qū)。在HBSAG陰性人群中，單項(xiàng)抗HBC，以及抗HBC伴抗HBS人群的HBVDNA陽(yáng)性率應(yīng)引起重視。建議在獻(xiàn)血員血液篩查時(shí)考慮進(jìn)行混合血清HBVDNA檢測(cè)以減少HBV感染發(fā)生。3江蘇省蘇南地區(qū)一般人群HCVAB陽(yáng)性率及HCVRNA檢出率均高于蘇中、蘇北地區(qū)。4混合血清HBVDNA、HCVRNA檢測(cè)方法已在江蘇省COO實(shí)驗(yàn)室初步建立。5對(duì)于不同混合條件下的混合檢驗(yàn)陽(yáng)性率結(jié)果，建議采用校正一次近似法或精確概率法進(jìn)行陽(yáng)性率的可信區(qū)間估計(jì)。

簡(jiǎn)介：重慶醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文重慶地區(qū)嬰幼兒輪狀病毒臨床及分子流行病學(xué)特征研究姓名廖煬申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)兒科學(xué)（感染消化）指導(dǎo)教師劉作義20100501重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文先用膠體金法初步篩查輪狀病毒并經(jīng)RTPCR逆轉(zhuǎn)錄PCR方法證實(shí)為輪狀病毒，然后用巢式RTPCR方法進(jìn)行VP7G、VP4P基因分型。3統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS160軟件統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)臨床資料和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。中位數(shù)比較使用非參數(shù)MANNWHIMEYU檢驗(yàn)，多個(gè)非正態(tài)分布獨(dú)立樣本中位數(shù)比較使用非參數(shù)KRUSKALWALLIS檢驗(yàn)。率的比較使用卡方檢驗(yàn)。以P值O05為差異有顯著性。4結(jié)果12008年8月“2009年7月共收集標(biāo)本1259份門診1054份，住院205份；男767例，女492例，其中輪狀病毒篩查陽(yáng)性例數(shù)為453份FLI參359份，住院94份；男266FFIJ，女187例。輪狀病毒總體陽(yáng)性率為3598％453／1259，其中門診3406％359／1054，住院4585％94／205；男性陽(yáng)性率3468％266／767，女性陽(yáng)性率3801％187／492。本研究資料顯示輪狀病毒腸炎患兒主要集中發(fā)生在6個(gè)月～14月齡嬰幼兒。重慶輪狀病毒腸炎全年都有發(fā)生，但是主要集中發(fā)生在當(dāng)年的LO月份至次年的2月份，在3、4月份時(shí)出現(xiàn)有小高峰，夏季79月份的陽(yáng)性率全年最低。2分析輪狀病毒流行季節(jié)的10月份至次年2月份嬰幼兒腹瀉情況，此期間共收集至1J507份嬰幼兒大便標(biāo)本，輪狀病毒抗原陽(yáng)4

簡(jiǎn)介：廣一關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下所完成的論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬蘭州大學(xué)。本人完全了解蘭州大學(xué)有關(guān)保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保存或向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的紙質(zhì)版和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權(quán)蘭州大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用任何復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。本人離校后發(fā)表、使用學(xué)位論文或與該論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時(shí)，第一署名單位仍然為蘭州大學(xué)。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。論文作者簽名襤導(dǎo)師簽名紐日期灶／夕■、／’目錄中文摘要1英文摘要4正文前言7日U舌7第一部分蘭州地區(qū)急性呼吸道感染患兒中呼吸道相關(guān)病毒檢測(cè)和臨床研究材料與方法16結(jié)果23J討論37結(jié)論44第二部分人博卡病毒2和C組鼻病毒的臨床特征及分子流行病學(xué)研究第一章人博卡病毒2HBOV2的臨床和分子流行病學(xué)研究45材料與方法45結(jié)果47討論51第二章人鼻病毒C組HRV_C感染的臨床和分子流行病學(xué)研究53材料與方法54結(jié)果55討論57結(jié)論60全文創(chuàng)新點(diǎn)61參考文獻(xiàn)62縮略語(yǔ)表69附圖170附圖272附表176攻讀學(xué)位期間撰寫及發(fā)表的論文77致射78

簡(jiǎn)介：最近幾十年來由于全球人口數(shù)量和流動(dòng)性持續(xù)增加登革熱在全球的流行范圍不斷擴(kuò)大并已成為目前世界上分布最廣、發(fā)病最多的蟲媒病毒病對(duì)人類健康造成嚴(yán)重的威脅。由于缺乏疫苗登革熱的防治一直是世界性難題。除了媒介控制外感染者的及時(shí)發(fā)現(xiàn)、隔離以及治療是目前預(yù)防登革熱進(jìn)一步擴(kuò)散的重要手段因此早期診斷對(duì)于登革熱的預(yù)防控制至關(guān)重要。登革熱的早期診斷一直是登革熱防治研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)也在不斷發(fā)展包括病毒核酸檢測(cè)、抗原抗體檢測(cè)在內(nèi)的多種實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)已被應(yīng)用于常規(guī)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)工作。目前國(guó)外已經(jīng)有多家試劑公司研制成功并推出了包括酶聯(lián)免疫吸附法ELISA、膠體金免疫層析法ICT等在內(nèi)的商品化病毒抗體檢測(cè)試劑盒此類試劑盒具有快速、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)為大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室特別是基層實(shí)驗(yàn)室所采用。近年來國(guó)內(nèi)雖然也有不少研究機(jī)構(gòu)開展登革病毒抗體檢測(cè)試劑盒的研制并有相關(guān)研制的報(bào)道但其實(shí)際應(yīng)用一直沒有取得突破試劑的國(guó)產(chǎn)化一直是國(guó)內(nèi)登革熱防控工作的短板。本課題以登革2型病毒外膜蛋白ENVELOPEE為研究對(duì)象在其編碼基因的DIII區(qū)上下游各設(shè)計(jì)8條引物分別引入NDEI和XHOI兩個(gè)酶切位點(diǎn)交叉配對(duì)共擴(kuò)增出64條DIII區(qū)基因片段利用PET30A表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌BL21DE3中分別克隆和表達(dá)經(jīng)SDSPAGE和WESTERNBLOT驗(yàn)證其表達(dá)含量及重組蛋白的免疫反應(yīng)性篩選表達(dá)量大且有較強(qiáng)免疫反應(yīng)性的重組蛋白抗原進(jìn)行純化并建立間接ELISA法用以檢測(cè)登革熱IGM抗體為國(guó)產(chǎn)試劑提供候選抗原和方法。為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)建立的ELISA法檢測(cè)效果我們以PANBIO公司生產(chǎn)的登革熱IGM檢測(cè)試劑盒作為對(duì)照選取112份臨床血清標(biāo)本進(jìn)行了初步的試劑評(píng)估。檢測(cè)結(jié)果表明以IFA檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)本研究ELISA法檢測(cè)IGM的靈敏度為9464％特異度為9107與PANBIO公司生產(chǎn)試劑盒相比本研究建立的ELISA法檢測(cè)登革病毒IGM抗體的檢測(cè)陽(yáng)性符合率為9285陰性符合率為8929總符合率為9107KAPPA值為08214提示兩檢測(cè)方法具有較高的一致性且兩種檢測(cè)方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Χ203P005。提示本研究所建立的方法具有較好的應(yīng)用前景。

簡(jiǎn)介：目的丙型肝炎病毒（HEPATITISCVIRUS，簡(jiǎn)稱HCV）感染是當(dāng)前危害人類健康的重要傳染病之一，目前除干擾素聯(lián)合利巴韋林外尚無有效預(yù)防和治療手段。因此，尋找其他治療途徑，預(yù)防和清除HCV的持續(xù)感染很有必要。而將編碼HCV抗原的外源基因?qū)霗C(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的HCV新型疫苗目前正在受到人們的重視。以重組復(fù)制缺陷型腺病毒REPLICATIONDEFICIENTRECOMBINANTADENOVIRUS，RAD為載體的疫苗，能模擬天然病毒有效地將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞內(nèi)并使之高效表達(dá)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)目的抗原的免疫應(yīng)答。為此，我們利用ADMAXTM腺病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建可表達(dá)HCV核心抗原CE的HCV重組腺病毒PADCE，并觀察其免疫小鼠后，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的能力，為進(jìn)一步研究防止HCV感染的基因疫苗和基因治療奠定基礎(chǔ)。方法RTPCR法從丙型肝炎患者血清中擴(kuò)增出HCVCE基因定向克隆到重組腺病毒ADMAXTM系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒PDC315的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒PDC315CE，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下與腺病毒基因組骨架質(zhì)粒PBHGLOXDELTAE13CRE共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，通過同源重組包裝產(chǎn)生復(fù)制缺陷型重組腺病毒PADCE；經(jīng)HEK293細(xì)胞擴(kuò)增后，離子交換柱層析法純化病毒，測(cè)定病毒顆粒數(shù)和滴度；利用重組腺病毒體外感染人肝癌細(xì)胞株HEPG2，經(jīng)免疫印跡（WESTERNBLOT）方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ENZYME1INKEDIMMUNOSBENTASSAY，ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清抗體水平，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ENZYMELINKEDIMMUNOSBENTSPOTELISPOT）檢測(cè)免疫小鼠特異性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)果重組腺病毒PADCE經(jīng)PCR及序列測(cè)定證實(shí)CE基因插入正確，在HEK293細(xì)胞中具有良好的感染性；擴(kuò)增純化后，重組腺病毒的比活性可達(dá)342IU100VP，單細(xì)胞產(chǎn)量可達(dá)263104VPCELL；WESTERNBLOT檢測(cè)結(jié)果表明PADCE在HEPG2細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，免疫小鼠后可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。結(jié)論成功構(gòu)建了表達(dá)HCV核心抗原CE的HCV重組腺病毒PADCE，該重組腺病毒可在人肝癌細(xì)胞株HEPG2細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，并且能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有成為丙肝疫苗的發(fā)展?jié)摿Α?

簡(jiǎn)介：眾所周知，現(xiàn)代免疫學(xué)主要的杰出貢獻(xiàn)是揭示了傳統(tǒng)免疫學(xué)中一系列令人迷惑的現(xiàn)象（1）T細(xì)胞通過其TCR分子識(shí)別由MHC分子遞呈的抗原肽，而從MHC分子的抗原肽結(jié)合槽中洗脫下來的分子，90％以上為自身抗原肽，包括各種類型的自身MHC分子，提示了T細(xì)胞識(shí)別自身成分具有的普遍性；（2）免疫應(yīng)答調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)變異可誘發(fā)自身免疫??；（3）盡管腫瘤患者免疫功能低下，但可檢測(cè)到較正常人高得多的自身抗體，并有自身抗原編碼基因的大量激活；（4）幾乎所有引起自身免疫病的病理性淋巴細(xì)胞克隆都可以在健康人的淋巴細(xì)胞庫(kù)（REPERTOIRE）中找到，頻率為1107左右?，F(xiàn)代免疫學(xué)的另一杰出貢獻(xiàn)是預(yù)示了用免疫調(diào)節(jié)和免疫干預(yù)的研究成果解釋了自身免疫病的發(fā)病機(jī)制和臨床應(yīng)用的可行性。機(jī)體免疫系統(tǒng)藉助正負(fù)反饋調(diào)節(jié)維持自身穩(wěn)定，當(dāng)穩(wěn)定遭至破壞即引起的兩個(gè)極端性病理效應(yīng)出現(xiàn)腫瘤持續(xù)感染（應(yīng)答不足）和自身免疫?。☉?yīng)答亢進(jìn)）。就后者而言，可能更多地涉及負(fù)反饋機(jī)理的失調(diào)。而負(fù)反饋失調(diào)如何造成自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞克隆的病理性擴(kuò)增，是一個(gè)重要的科學(xué)問題。多發(fā)性硬化癥（MS）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）作為自身免疫病“三大頑癥”，由于所具有的危害性和可能相似的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)理已被列為我國(guó)關(guān)注的重大疾病。多發(fā)性硬化癥（MULTIPLESCLEROSIS，MS）嚴(yán)重累及患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CENTRALNERVOUSSYSTEM，CNS）。該病始發(fā)于2040歲的青壯年，在美國(guó)每年至少有350萬(wàn)人患發(fā)MS，在我國(guó)，MS正以每年50萬(wàn)人數(shù)的發(fā)病率遞增。該病會(huì)造成感覺缺陷如運(yùn)動(dòng)、自律和神經(jīng)認(rèn)知功能的障礙而導(dǎo)致勞動(dòng)力喪失，雖然MS通常不會(huì)明顯縮短患者的壽命，但該病對(duì)于社會(huì)經(jīng)濟(jì)所造成負(fù)擔(dān)，其影響僅次于對(duì)患者身體的傷害。作為一個(gè)復(fù)雜性狀的疾病，MS被認(rèn)為是由環(huán)境因素和人類易感基因的相互作用而導(dǎo)致機(jī)體的免疫失衡。但其確切的發(fā)病機(jī)理仍“眾說紛紜”。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RHEUMATOIDARTHRITIS，RA）同屬一種病因未明的以侵犯四肢關(guān)節(jié)為主的常見自身免疫病。在我國(guó)乃至亞洲，RA的發(fā)病率高達(dá)04％1％，且具有高達(dá)15％的致殘率。目前正以每年400萬(wàn)新增病例遞增。同其它自身免疫病一樣，長(zhǎng)期以來仍限于用激素或非甾體類藥物姑息治療。雖然MS和RA的發(fā)病機(jī)理仍未完全明了，然而其免疫學(xué)介導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制研究早已提示患者的遺傳背景、內(nèi)分泌因素、環(huán)境差異、細(xì)胞凋亡、尤以病毒感染與MSRA發(fā)病可能密切相關(guān)，再者自身反應(yīng)性T細(xì)胞以及其分泌的炎癥因子均是MS和RA患者發(fā)病的高危因素。近年來本論文作者所在的上海市免疫學(xué)研究所與瑞金醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、新華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科開展了MS的合作研究，特別是與上海市長(zhǎng)寧區(qū)光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院合作，在國(guó)家自然科學(xué)基金、863項(xiàng)目、上海市科委重大和重點(diǎn)項(xiàng)目基金的資助下，率先建立了RA基礎(chǔ)和臨床合作研究梯隊(duì)及技術(shù)平臺(tái)，完善了一定規(guī)模的MSRA樣本庫(kù)，并從免疫遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)多方面入手研究并取得了多項(xiàng)成果，相應(yīng)論文發(fā)表在2006年GENESIMMUNITY和2007年ARTHRITISRHEUMATISM等雜志上。然而，我們發(fā)現(xiàn)在前期經(jīng)T細(xì)胞疫苗干預(yù)治療的RA患者中仍有部分RA患者其ACR僅為20，且自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆并未隨著TCV療程而消失；因此揭示和闡明MS和RA真正的發(fā)病機(jī)制的本質(zhì)變得尤為重要。人們推測(cè)HHV6EBV可能是導(dǎo)致MS和RA發(fā)病的“罪魁禍?zhǔn)住?，其中可能的致病機(jī)理是基于病毒的“分子模擬”。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HHV6和MBP，EBVGP110與HLADRW4具有同源序列。當(dāng)病毒與MS的自身抗原MBP享有的共同肽段或抗原表位，EBVGP110與HLADRW4的MSRA患者體內(nèi)被誘導(dǎo)和激活的TB細(xì)胞經(jīng)胸腺陽(yáng)性選擇隨即進(jìn)入外周末梢，可能就在感染期通過某種機(jī)制穿過血腦屏障或穿行至關(guān)節(jié)腔，這些T細(xì)胞（被稱為自身反應(yīng)性T細(xì)胞）在識(shí)別具有“交叉反應(yīng)”的病毒肽段的同時(shí)也將表達(dá)于自身神經(jīng)髓鞘的MBP和具有HLADRW4表位的組織細(xì)胞視為“靶抗原”攻擊之，造成腦組織損傷和關(guān)節(jié)滑膜組織的損傷以至MS和RA的發(fā)生。然而盡管有很多證據(jù)說明病毒的“分子模擬”是一個(gè)較為合理的假說，可以用其來解釋MS和RA與HHV6EBV感染之間的關(guān)系，但作為MS和RA的真正發(fā)病機(jī)制還需要提供更多的免疫病理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因此本論文第一部分提出的科學(xué)問題是闡明HHV6病毒感染與多發(fā)性硬化癥發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。本論文的第二部分所要闡述的科學(xué)問題除了繼續(xù)闡明RA的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)理并且首次嘗試應(yīng)用具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)雙重功能的IFNΒ，在觀察其使用的安全性和可行性的同時(shí)，分析其具有的免疫調(diào)節(jié)功能。旨在為闡明MS特別是RA的發(fā)病機(jī)制，為臨床找到既有抗病毒作用又同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)和免疫重建的新療法提供前期工作和數(shù)據(jù)。

簡(jiǎn)介：腸道病毒71型（ENTEROVIRUS71，EV71）是導(dǎo)致嬰幼兒感染的重要病原之一，可引起多種疾病，具有較廣的疾病譜。其中由EV71引起的兒童手足口?。℉，F(xiàn)OOT，MOUTHDISEASE，HFMD）最為常見，而且在嬰幼兒容易造成腦干腦炎等神經(jīng)系統(tǒng)感染導(dǎo)致死亡。EV71近年有多地區(qū)流行的趨勢(shì)。EV71在分類上屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，基因組為正鏈單股RNA?；蚪M全長(zhǎng)7500BP，編碼區(qū)僅有一個(gè)開放閱讀框（F），編碼約2200個(gè)氨基酸的多聚蛋白（POLYPROTEIN），該多聚蛋白可進(jìn)一步被水解成P1、P2、P3三個(gè)前體蛋白，P1蛋白在3CD蛋白酶的切割作用下生成VP1、VP2、VP3與VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白。其中VP1、VP2和VP3裸露于病毒顆粒的表面，VP4位于病毒顆粒衣殼內(nèi)側(cè)與基因組RNA緊密連接，共同構(gòu)成EV71的抗原區(qū)。研究資料表明，雖然該病毒主要抗原決定區(qū)位于VP1，但是VP2、VP3以及VP4上均有抗原抗體結(jié)合功能；已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單獨(dú)的VP1和VP3免疫原性有限，若能獲得VP1～VP4，免疫原性將會(huì)得到明顯提高。鑒于此，我們首先對(duì)從流行區(qū)分離的EV71病毒進(jìn)行了血清學(xué)和分子生物學(xué)方面的鑒定，采用RTPCR的方法克隆了P1和3CD基因，借助于載體PCDNA30BA構(gòu)建雙順反子穿梭質(zhì)粒PSHUTTLECMVP13CD和單基因的穿梭質(zhì)粒PSHUTTLECMVP1與PSHUTTLECMV3CD。經(jīng)同源重組獲得了重組腺病毒質(zhì)粒RADP13CD、RADP1、RAD3CD，分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝，獲得相應(yīng)的重組腺病毒RADP13CD、RADP1和RAD3CD，經(jīng)RTPCR檢測(cè)表明，三個(gè)重組腺病毒均已轉(zhuǎn)錄目的基因MRNA；免疫熒光和免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明僅雙順反子重組腺病毒RADP13CD中可檢測(cè)到特異性目的蛋白，而RADP1、RAD3CD中未能檢測(cè)到特異性的表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果表明重組腺病毒可有效表達(dá)EV71P1和3CD基因，僅含P1或3CD基因的重組腺病毒表達(dá)產(chǎn)物未能被特異性抗體所識(shí)別，而含P1及3CD蛋白酶基因的雙順反子重組腺病毒表達(dá)產(chǎn)物具有EV71特異抗原性，提示P1蛋白只有在3CD蛋白酶的切割作用下才具有抗原性；重組腺病毒通過滴鼻、灌胃和皮下注射的方式分別免疫BALBC小鼠，ELISA法檢測(cè)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中均檢測(cè)到抗EV71特異性IGG的抗體，且由RADP13CD免疫后產(chǎn)生的抗體水平明顯高于RADP1和RAD3CD共免疫產(chǎn)生的抗體水平；三種不同的免疫方式結(jié)果證明，灌胃免疫方式最佳，滴鼻次之，皮下注射產(chǎn)生的抗體水平最低。目前有限次數(shù)的中和試驗(yàn)還未能在實(shí)驗(yàn)組血清中檢測(cè)到EV71特異性保護(hù)作用，其原因還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)成功克隆了包含EV71全部結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)基因P1和具有切割作用的蛋白酶3CD，初步探索了EV71病毒蛋白之間的相互作用，為研究EV71結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白之間的關(guān)系打下了基礎(chǔ)；為找尋最合理的相關(guān)重組腺病毒疫苗的免疫方式做了初步的探索實(shí)驗(yàn)，為EV71基因工程疫苗的研究做了前期的基礎(chǔ)工作。

簡(jiǎn)介：目的了解河北省不同地區(qū)、不同人群中肝炎病毒的感染狀況和流行趨勢(shì)，掌握其流行特征，分析該省人群中肝炎病毒的感染相關(guān)因素，評(píng)價(jià)人群乙肝疫苗接種效果，為乙肝的科學(xué)防控提供基礎(chǔ)。方法2011年在河北地區(qū)常駐人口中開展血清流行病學(xué)研究，運(yùn)用多階段整群系統(tǒng)隨機(jī)抽樣方法，隨機(jī)抽取22個(gè)縣區(qū)，按照系統(tǒng)抽樣法抽取縣區(qū)內(nèi)以家庭為單位的1～59歲居民，進(jìn)行問卷調(diào)查，并同時(shí)靜脈采血5ML。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA檢測(cè)血樣中乙肝病毒表面抗原HBSAG、乙肝病毒表面抗體抗HBS和乙肝病毒核心抗體抗HBC。利用EPIDATA310軟件對(duì)調(diào)查問卷及檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行雙錄入，運(yùn)用EXCEL和EPIINFO軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析。結(jié)果1本次調(diào)查全省11個(gè)市的22個(gè)縣（區(qū)），共抽樣5072人，有流行病學(xué)調(diào)查資料和有實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的有效樣本4567人，應(yīng)答率為9004％。調(diào)查城市人口2311人，農(nóng)村人口2256人，分別占調(diào)查總?cè)丝诘?060％和4940％。男、女性別比為1∶106。2全省1～59歲人群HBSAG、抗HBS、抗HBC分別為331％、4335％、2967％。其中HBSAG陽(yáng)性率最高的廊坊499％，最低的是唐山127％石家莊抗HBS陽(yáng)性率最高，為56％。3城鄉(xiāng)人群HBSAG陽(yáng)性率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，農(nóng)村高于城市城市人群抗BS陽(yáng)性率高于農(nóng)村，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義農(nóng)村人群抗HBC陽(yáng)性率高于城市，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。41～4歲調(diào)查人群乙肝疫苗全程接種率和首針及時(shí)接種率分別為9405％、9405％，5～19歲調(diào)查人群乙肝疫苗全程接種率和首針及時(shí)接種率分別為7090％、5543％。年齡愈大，乙肝疫苗全程接種率和首針及時(shí)接種率愈低。5將14個(gè)因素與乙肝HBSAG陽(yáng)性的關(guān)系通過用LOGISTIC回歸模型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)家庭有HBSAG陽(yáng)性成員是影響乙肝感染的危險(xiǎn)因素。結(jié)論1河北省人群HBSAG陽(yáng)性率為331％，與1992年調(diào)查的HBSAG陽(yáng)性率相比，HBSAG陽(yáng)性率明顯下降。按照世界衛(wèi)生組織分類標(biāo)準(zhǔn)，我省處于中流行區(qū)（8％＞HBSAG陽(yáng)性率≥2％）。2河北省已經(jīng)實(shí)現(xiàn)2006～2010年全國(guó)乙型病毒性肝炎防治規(guī)劃全人群HBSAG陽(yáng)性率將至7％以下的控制目標(biāo)。3河北省農(nóng)村地區(qū)HBSAG陽(yáng)性率高于城市，15～29歲人群陽(yáng)性率最高，以男性為主。4HBSAG陽(yáng)性率與文化程度呈負(fù)相關(guān)不同民族HBSAG陽(yáng)性率亦不相同。5乙肝疫苗接種已有大幅提高，低年齡組全程接種率及首針及時(shí)率農(nóng)村與城市已無差別。6通過用LOGISTIC回歸模型對(duì)調(diào)查的多種影響因素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)家庭有HBSAG陽(yáng)性成員是影響乙肝感染的危險(xiǎn)因素。7人群抗HBS陽(yáng)性率水平較1992年明顯上升，乙肝疫苗接種已取得顯著效果。

簡(jiǎn)介：【背景】漢灘病毒HANTAANVIRUSHTNV在我國(guó)主要引起腎綜合征出血熱HEMRHAGICFEVERWITHRENALSYNDROMEHFRS該病危害極為嚴(yán)重目前尚缺乏特效的治療藥物主要使用疫苗進(jìn)行預(yù)防。目前我國(guó)已成功研制HFRS滅活疫苗其推廣使用對(duì)預(yù)防HFRS的發(fā)生和流行起到了積極作用。但該類疫苗仍存在一些問題主要是不能有效刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力也較弱抗體滴度不高等因而研發(fā)新型的HFRS疫苗成為當(dāng)務(wù)之急。近年來病毒樣顆粒VIRUSLIKEPARTICLEVLP疫苗由于其安全性好和免疫原性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)使得其成為目前最有發(fā)展前景的新型基因工程候選疫苗之一。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)通過對(duì)VLP進(jìn)行修飾將細(xì)胞因子錨定到VLP表面使其成為嵌合VLP可以使其具有更好的免疫原性。本研究通過桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)BACULOVIRUSEXPRESSIONVECTSYSTEMBEVS分別表達(dá)HTNV包膜糖蛋白GLYCOPROTEINGP和核衣殼蛋白NUCLEOCAPSIDPROTEINNP來構(gòu)建HTNVVLP同時(shí)表達(dá)糖基磷脂酰肌醇GLYCOSYLPHOSPHATIDYLINOSITOLGPI錨定的粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子GRANULOCYTEMACROPHAGECOLONYSTIMULATINGFACTGMCSF或CD40配體CD40LIGCD40L使之修飾在VLP表面獲得了兩種HTNV嵌合VLPVLPGMCSFVLPCD40L并對(duì)其生物學(xué)活性和免疫學(xué)特性進(jìn)行了研究以期為進(jìn)一步研制HFRS新型基因工程疫苗奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。【方法】將HTNV76118株編碼GP的M基因和編碼NP的S基因以及小鼠的GPIGMCSF以下簡(jiǎn)稱GMCSF、CD40L基因分別克隆入BEVS中的PFASTBACTMDUAL轉(zhuǎn)移載體中構(gòu)建各重組桿狀病毒RECOMBINANTBACULOVIRUSRBV轉(zhuǎn)移載體PFASTBACTMDUALM、PFASTBACTMDUALS、PFASTBACTMDUALGMCSF、PFASTBACTMDUALCD40L酶切后瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定并進(jìn)行序列測(cè)定。將構(gòu)建好的各RBV轉(zhuǎn)移載體分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌ESCHERICHIACOLIECOLIDH10BACTM后提取各RBV桿粒即BACM、BACS、BACGMCSF、BACCD40L并利用PCR進(jìn)行鑒定。將構(gòu)建好的各RBV桿粒轉(zhuǎn)染SF9昆蟲細(xì)胞后獲得各RBV分別命名為RBVM、RBVS、RBVGMCSF、RBVCD40L。取各RBV感染SF9昆蟲細(xì)胞利用間接免疫熒光法INDIRECTIMMUNOFLUESCENCEASSAYIFA檢測(cè)各目的蛋白的表達(dá)。將RBVM、RBVS以及RBVGMCSF或RBVCD40L通過共感染SF9昆蟲細(xì)胞的方式分別制備各組VLPVLP、VLPGMCSF、VLPCD40L在電鏡下觀察SF9昆蟲細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中的各組VLP的組裝情況。分別大量制備和收集各組VLP通過蔗糖密度梯度離心法純化各組VLP并利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ENZYMELINKEDIMMUNOADSDENTASSAYELISA、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳SODIUMDODECYLSULFATEPOLYACRYLAEGELELECTROPHESISSDSPAGE、蛋白質(zhì)印跡法WESTERNBLOTWB、免疫共沉淀COIMMUNOPRECIPITATIONCOIP等方法進(jìn)行鑒定。在上述工作的基礎(chǔ)上研究分析了各組VLP的生物學(xué)活性及免疫學(xué)特性。通過流式細(xì)胞術(shù)FLOWCYTOMETRYFCM分別檢測(cè)了各組VLP促小鼠骨髓細(xì)胞增殖能力、促小鼠骨髓細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞DENDRITICCELLSDC分化能力以及促B淋巴細(xì)胞活化能力。將各組VLP通過皮下注射途徑免疫C57BL6小鼠以添加外源重組細(xì)胞因子的VLPVLPGMCSF、VLPCD40L、HFRS滅活疫苗以及PBS為對(duì)照。通過ELISA及微量細(xì)胞中和試驗(yàn)分別檢測(cè)免疫后各組小鼠血清中抗HTNVGP及NP的特異性抗體及中和抗體的滴度以反映各組小鼠的體液免疫應(yīng)答的情況通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)ENZYMELINKEDIMMUNOSPOTASSAYELISPOT及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞CYTOTOXICTLYMPHOCYTECTL殺傷試驗(yàn)分別檢測(cè)免疫后各組小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平以及其CTL殺傷活性以反映各組小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答的情況取HTNV76118株通過肌肉注射途徑接種各組免疫小鼠通過ELISA及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)QUANTITATIVEREALTIMEPOLYMERASECHAINREACTIONQRTPCR分別檢測(cè)接種后各組免疫小鼠臟器組織中HTNV抗原及核酸通過蘇木精伊紅HEMATOXYLINEOSINHE染色各組小鼠臟器組織并進(jìn)行鏡檢觀察接種后各組免疫小鼠臟器組織的病理學(xué)變化以評(píng)價(jià)各組VLP預(yù)防接種對(duì)HTNV感染的保護(hù)作用?！窘Y(jié)果】將各目的片段克隆入BEVS轉(zhuǎn)移載體后酶切鑒定結(jié)果顯示各RBV轉(zhuǎn)移載體均切出與相應(yīng)目的基因大小相一致的核酸條帶測(cè)序結(jié)果顯示各目的基因序列正確無突變產(chǎn)生表明成功地構(gòu)建了各RBV轉(zhuǎn)移載體。對(duì)重組桿粒PCR鑒定結(jié)果顯示各RBV桿粒中均擴(kuò)增出與預(yù)期大小相一致的核酸條帶證實(shí)各組RBV桿粒構(gòu)建正確。將各重組桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞獲得RBV感染細(xì)胞后IFA檢測(cè)結(jié)果顯示各組RBV均可表達(dá)相應(yīng)的目的蛋白。將各RBV共感染昆蟲細(xì)胞后電鏡觀察結(jié)果顯示在昆蟲細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中均可清楚地觀察到直徑大小約為80220NM的顆粒初步判定為各組VLP。大量制備各組VLP利用蔗糖密度梯度離心進(jìn)行純化離心結(jié)束后能夠清晰的觀察到各組VLP的聚集帶。SDSPAGE及WB檢測(cè)各組VLP結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組VLP中均含有與相應(yīng)目的蛋白大小相一致的特異性蛋白條帶。ELISA及COIP檢測(cè)結(jié)果顯示在嵌合VLP中GMCSF或CD40L均成功地錨定在VLP上。對(duì)各VLP進(jìn)行生物學(xué)活性檢測(cè)的結(jié)果顯示各組VLP均可刺激小鼠骨髓細(xì)胞的增殖和向DC的分化并有效地促進(jìn)了小鼠B淋巴細(xì)胞的活化且VLPGMCSF的刺激能力要強(qiáng)于VLPCD40L和VLPP005。在HTNVGP或NP刺激下與PBS組相比各組VLP均可增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞的殺傷活性且隨著效靶比EFFECTCELLTARGETCELLET的升高而增強(qiáng)。VLPCD40L、VLPGMCSF組小鼠脾細(xì)胞殺傷活性在不同ET時(shí)均高于VLP組、滅活疫苗組以及相應(yīng)的外源細(xì)胞因子添加組其中VLPCD40L組殺傷活性最高P免疫小鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示PBS對(duì)照組小鼠的肝臟、脾臟和腎臟組織中的HTNV抗原檢測(cè)均為陽(yáng)性而其他各實(shí)驗(yàn)組以及正常對(duì)照組小鼠的所有臟器組織均未檢測(cè)到HTNV抗原。RTPCR檢測(cè)各組小鼠臟器中HTNV核酸的結(jié)果與病毒抗原結(jié)果結(jié)果相一致。HE染色鏡檢結(jié)果顯示PBS組小鼠的脾臟中出現(xiàn)了彌漫性出血淋巴細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)以及白髓增多等病理學(xué)變化而其他各實(shí)驗(yàn)組以及正常對(duì)照組小鼠的所有臟器組織均未觀察到病理學(xué)變化。上述結(jié)果提示HTNV能夠感染未經(jīng)免疫的C57BL6小鼠而經(jīng)各VLP免疫后能夠保護(hù)小鼠免受HTNV的攻擊?！窘Y(jié)論】本研究通過BEVS表達(dá)系統(tǒng)獲得了嵌合有GMCSF或CD40L的HTNVVLP各嵌合VLP均具有有良好的生物學(xué)活性同時(shí)嵌合在VLP表面的CD40L或GMCSF有效地增強(qiáng)了其刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的能力且各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于HFRS滅活疫苗組。免疫小鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)嵌合VLP可以有效地保護(hù)C57BL6小鼠免受HTNV的攻擊。本研究為進(jìn)一步研制HFRS新型基因工程疫苗奠定了良好的理論、實(shí)驗(yàn)和物質(zhì)基礎(chǔ)。