HCV重組腺病毒的構建、鑒定及初步免疫學效果觀察.pdf

1、目的:丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，簡稱HCV）感染是當前危害人類健康的重要傳染病之一，目前除干擾素聯(lián)合利巴韋林外尚無有效預防和治療手段。因此，尋找其他治療途徑，預防和清除HCV的持續(xù)感染很有必要。而將編碼HCV抗原的外源基因導入機體誘導產生特異性T細胞免疫反應的HCV新型疫苗目前正在受到人們的重視。以重組復制缺陷型腺病毒(replication-deficient recombinant adenovirus，rA

2、d)為載體的疫苗，能模擬天然病毒有效地將外源基因導入宿主細胞內并使之高效表達，誘導機體產生針對目的抗原的免疫應答。為此，我們利用AdMaxTM腺病毒包裝系統(tǒng)構建可表達HCV核心抗原Core的HCV重組腺病毒 pAd-Core，并觀察其免疫小鼠后，誘導機體產生特異性免疫應答的能力，為進一步研究防止HCV感染的基因疫苗和基因治療奠定基礎。 方法：RT-PCR法從丙型肝炎患者血清中擴增出HCV Core基因,定向克隆到重組腺病毒AdM

3、axTM系統(tǒng)的穿梭質粒pDC315的多克隆位點上，構建重組穿梭質粒pDC315-Core，在脂質體介導下與腺病毒基因組骨架質粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉染至HEK293細胞，通過同源重組包裝產生復制缺陷型重組腺病毒 pAd-Core；經HEK293細胞擴增后，離子交換柱層析法純化病毒，測定病毒顆粒數和滴度；利用重組腺病毒體外感染人肝癌細胞株HepG2，經免疫印跡（Western Blot）方法檢測目的蛋白的表達，通過

4、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme 1inked immunosorbent assay，ELISA)檢測免疫小鼠血清抗體水平，酶聯(lián)免疫斑點技術（enzyme-linked immunosorbent spot ,ELISPOT）檢測免疫小鼠特異性T淋巴細胞免疫反應。 結果:重組腺病毒 pAd-Core經PCR及序列測定證實Core基因插入正確，在HEK293細胞中具有良好的感染性；擴增純化后，重組腺病毒的比活性可達3.42IU/1