2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:構建攜帶PPARγ<,2>基因的腺病毒載體,為進一步研究PPARγ<,2>基因的功能,為闡明HBV感染導致肝癌的機制研究建立基礎。 方法:本課題采用PCR技術從pcDNA3質粒中擴增小鼠PPARγ<,2>基因,將PPARγ<,2>基因亞克隆至質粒穿梭載體pAdTrack-CMV中,同時與pAdEasy-1共轉染293細胞,確定轉染率,并轉化到肝臟L02細胞表達。 第一部分:以小鼠PPARγ<,2>基因質粒(PPAR

2、γ<,2>-pcDNA3)為材料,通過PCR方法擴增小鼠PPARγ<,2>基因,獲得目的基因PPARγ<,2>,分別用Sal Ⅰ和Xho Ⅰ酶切PPARγ<,2>基因片段和pAdTrack-CMV,用T4DNA Ligase(連接酶)連接,將PPARγ<,2>基因片段亞克隆到pAdTrack-PPARγ<,2>-CMV中,構建腺病毒(adenovirus)穿梭質粒載體。正確重組的pAd-track-PPARγ<,2>,用PmeⅠ線性化后

3、與pAd Easy-1在BJ5183中同源重組,酶切得到一條23 kb左右的大片段和一條約4.5kb的特征性小片段,表明重組腺病毒質粒構建成功。 結果:經PCR擴增的PPARγ<,2>片段克隆到腺病毒載體中,獲得目的基因的測序結果與GENEBANK報道的序列一致(pubmed RID:1144300157-17643-133739705 380BLASTQ1)。正確重組的pAd-track-PPARγ<,2>用PmeI線性化后與

4、pAd Easy-1在B55183中同源重組,PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳,以pAd Easy-1為對照,重組腺病毒質粒酶切可見一條23 kb左右的大片段和一條約4.5kb的特征性小片段,表明重組腺病毒質粒構建成功。 第二部分:重組腺病毒的包裝、鑒定及表達,用脂質體(lipid body)轉染法(infection protocol),將重組腺病毒pAdTrack-PPARγ<,2>-CMV和pAdEasy-1共轉染HEK

5、293細胞,包裝成pAdEasy-PPARγ<,2>腺病毒,確定轉染效率。檢測培養(yǎng)上清液病毒中PPARγ<,2>的存在后,將重組腺病毒基因轉導到L02細胞中,經RT-PCR檢測和Western blotting蛋白質表達,感染的重組PPARγ<,2>基因在L02細胞中能較高的穩(wěn)定表達。 結果:RT-PCR檢測結果顯示,腺病毒Ad-PPARγ<,2>PCR產物約為470bp;用抗PPARγ<,2>單克隆抗體做western blo

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