嗜肝細(xì)胞重組腺病毒基因治療載體的構(gòu)建.pdf

1、目的:重組腺病毒(rAd)是常用的基因治療載體,但它缺乏嗜肝性,本課題通過改造rAd纖毛結(jié)構(gòu),擬構(gòu)建出具有嗜肝性的rAd載體,用于肝病靶向基因治療。
　　 方法:以目前常用的rAd高表達(dá)載體系統(tǒng)AdEasy System為基礎(chǔ),用乙型肝炎病毒(HBV)衣殼蛋白中具有天然嗜肝性的肽段PreS1的21-47位氨基酸的編碼基因(preS1),定點(diǎn)克隆至AdEasy System中骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的HI Loop編碼基因位點(diǎn),

2、構(gòu)建出重組骨架質(zhì)粒pAdEasy-1-preS1,再用pAdEasy-1-preS1與穿梭質(zhì)粒pShuttle-IRES-hrGFP-1同源重組成病毒質(zhì)粒pAd-presl,經(jīng)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后包裝生成重組腺病毒基因治療載體rAd-PreS1。
　　 結(jié)果:克隆了preS1基因片段的腺病毒重組子經(jīng)測序顯示基因序列正確；病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,一周后進(jìn)行熒光觀察發(fā)現(xiàn)其表達(dá)出熒光蛋白,提示有腺病毒生成；以重組腺病毒基因?yàn)槟?/p>

3、板行PCR檢測能提取嗜肝性基因片段preS1；抽提重組腺病毒蛋白用免疫印跡法能檢測到目標(biāo)蛋白PreS1(21-47)的表達(dá),提示有重組腺病毒基因治療載體rAd-PreS1的生成；用構(gòu)建的rAd-PreS1感染多種細(xì)胞,病毒滴度檢測顯示對肝細(xì)胞具有相對嗜向性。
　　 結(jié)論:在rAd纖毛球域HI Loop的編碼基因位點(diǎn)插入HBV表面蛋白中嗜肝性片段PreS1的21-47位氨基酸的編碼基因preS1,經(jīng)HEK293細(xì)胞包裝生成的重組腺