CVB3VP1蛋白與重組腺病毒及重組質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用的免疫效果.pdf

1、目的：柯薩奇病毒B組3型（Coxsackievirus group B type3，CVB3）感染所致的病毒性心肌炎嚴(yán)重危害人類健康，也是新生兒猝死的重要原因，迄今尚無有效的預(yù)防方法。VP1是CVB3的主要衣殼蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。研究表明，編碼VP1的DNA疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并對小鼠有一定的保護(hù)能力，但不能有效阻止致死量病毒感染。
　　 目前提高免疫效果的關(guān)鍵因素之一是開發(fā)具有較高基因轉(zhuǎn)移率和靶向特

2、異性的轉(zhuǎn)基因載體。在眾多載體體系中，復(fù)制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)以其廣泛的宿主范圍、極高的轉(zhuǎn)染效率、外源基因高表達(dá)以及病毒滴度高等特點(diǎn)，在疫苗載體選擇中表現(xiàn)出優(yōu)勢，成為極具應(yīng)用前景的基因轉(zhuǎn)移載體。但由于腺病毒載體自身免疫原性較強(qiáng)，對自身抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答而不能多次應(yīng)用。
　　 蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的免疫原性，免疫動(dòng)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)的抗體。從病原體中提取具有免疫保護(hù)作用的蛋白，或利用DNA重組技術(shù)使重組體表達(dá)蛋白、多肽或合成肽制成的疫苗，稱為

3、亞單位疫苗。亞單位疫苗不含感染性組分，無須滅活，也無致病性。但也有研究表明，某些病原體亞單位疫苗的免疫原性低，不能達(dá)到滿意的免疫保護(hù)作用。
　　 近年有研究顯示，采用prime-boost方法將不同疫苗聯(lián)合應(yīng)用能明顯提高免疫效果。本研究采用prime-boost方法將CVB3重組腺病毒Ad/vp1與CVB3/VP1 DNA疫苗或CVB3VP1蛋白疫苗聯(lián)合應(yīng)用免疫小鼠，觀察免疫效果。
　　 方法：
　　 1.將前期

4、構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-his/VP1轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21（DE3）pLysS，誘導(dǎo)表達(dá)攜帶有6×HIS標(biāo)簽的VP1蛋白，分別利用HIS單抗和CVB3多抗經(jīng)Western-blot鑒定無誤后對目的蛋白進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)。將大量誘導(dǎo)表達(dá)的菌體在冰浴中超聲破碎，分離上清和包涵體沉淀，對該蛋白的水溶性進(jìn)行分析。將包涵體溶液經(jīng)金屬鎳離子基質(zhì)親和層析柱純化，獲得純化的蛋白。
　　 2.用堿裂解法從轉(zhuǎn)化的DH5α大腸桿菌中大量提取質(zhì)粒pcD

5、NA3/VP1，用聚乙二醇沉淀法進(jìn)行純化。
　　 3.將本室前期構(gòu)建的Ad/vp1第三代病毒液感染293細(xì)胞，逐日觀察細(xì)胞病變，待80％的細(xì)胞出現(xiàn)病變后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液，用GENMED腺病毒沉淀法純化試劑盒純化。
　　 4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將6～8周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為（1）～（8）組，每組18只。分別為（1）PBS組：肌肉注射PBS，每3周1次，共3次；（2）質(zhì)粒組：肌肉注射pcDNA3/VP1，每3周1次，共3

6、次；（3）腺病毒組：肌肉注射Ad/vp1，每3周1次，共2次；（4）質(zhì)粒/腺病毒組：第1、2次注射pcDNA3/VP1，第3次注射Ad/vp1，各次間隔3周；（5）腺病毒/質(zhì)粒組：第1次注射Ad/vp1，第2、3次注射pcDNA3/VP1，各次間隔3周；（6）蛋白/腺病毒組：第1、2次注射VP1蛋白，第3次注射Ad/vp1，各次間隔3周；（7）腺病毒/蛋白組：第1次注射Ad/vp1，第2、3次注射VP1蛋白，各次間隔3周；（8）蛋白組：

7、每3周注射1次，共3次。質(zhì)粒采用股四頭肌接種，接種前注射25％高滲蔗糖溶液100μl，20min后原位注射質(zhì)粒100μg/100μl；VP1蛋白以PBS稀釋后，采用肌肉注射免疫，每次接種100μg/只。初次免疫用完全弗氏佐劑，加強(qiáng)免疫用不完全弗氏佐劑；重組腺病毒Ad/vp1以PBS稀釋，每次肌肉接種4×107pfu/只。每次免疫后第14天，內(nèi)眥靜脈取血，分離血清，用微量中和試驗(yàn)檢測血清CVB3特異性中和抗體，用ELISA檢測IgG抗體；

8、第三次免疫后3周，每組3只小鼠取脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK一8）法進(jìn)行特異性淋巴細(xì)胞增殖活性和特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）殺傷活性的檢測；另每組12只小鼠用致死量的CVB3（4.5LD50）進(jìn)行腹腔注射，觀察并記錄小鼠死亡情況至感染后第21天；每組剩余的3只小鼠用3LD50CVB3攻擊，注射病毒后第7天采血，測定血中病毒滴度

9、。
　　 結(jié)果：
　　 1.酶切鑒定結(jié)果證實(shí)成功提取了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3/VP1。
　　 2.在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS中成功表達(dá)了CVB3 VP1蛋白，表達(dá)蛋白主要以包涵體形式存在。
　　 3.用293細(xì)胞大量擴(kuò)增了重組腺病毒并進(jìn)行了純化。
　　 4.每次免疫后14天，取血，測各組血清中和抗體的平均效價(jià)分別為：PBS對照組未檢測到；pcDNA3/VP1質(zhì)粒組1：5.30，1

10、：17.82，1：23.78；腺病毒組1：5.61，1：15.87；質(zhì)粒/腺病毒組1：5.30，1：17.82，1：29.96；腺病毒/質(zhì)粒組1：5.61，1：17.82，1：28.28；蛋白/腺病毒組1：8.91，1：47.56，1：67.26；腺病毒/蛋白組1：5.61，1：16.82，1：56.56；蛋白組1：8.91，1：47.56，1：71.26。單因素方差分析表明，除PBS對照組外，其余各組中和抗體滴度逐次增加（P<0.05

11、）；第三次免疫后，蛋白組中和抗體滴度高于質(zhì)粒pcDNA3/VP1組和腺病毒/蛋白組（P<0.05）。
　　 5.測各組血清特異性IgG抗體水平分別為：PBS組各次效價(jià)均低于1：50；質(zhì)粒組1：50，1：640，1：960；腺病毒組1：70，1：880；質(zhì)粒/腺病毒組1：50，1：640，1：2880；腺病毒/質(zhì)粒組1：70，1：360，1：1280；蛋白/腺病毒組1：440，1：17920，1：23040；腺病毒/蛋白組1：70

12、，1：2880，1：20480；蛋白組1：440，1：21333，1：38400。單因素方差分析表明，除PBS對照組外，其余各組IgG抗體滴度逐次增加（P<0.05）；第三次免疫后，蛋白組IgG抗體滴度高于PBS組、腺病毒組、質(zhì)粒pcDNA3/VP1組、蛋白/腺病毒組、腺病毒/蛋白組（P<0.05）；質(zhì)粒/腺病毒組抗體滴度也高于質(zhì)粒pcDNA3/VP1組。
　　 6.小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)分別以CVB3和刀豆蛋A（concan

13、avalin A，ConA）體外刺激淋巴細(xì)胞，檢測細(xì)胞增殖活性。單因素方差分析表明，蛋白參與各組的增殖活性均顯著高于PBS組和質(zhì)粒組（P<0.05）。
　　 7.特異性CTL殺傷活性經(jīng)單因素方差分析表明，質(zhì)粒/腺病毒組、腺病毒/質(zhì)粒組、蛋白/腺病毒組、腺病毒/蛋白組、蛋白組小鼠的CTL特異性殺傷率明顯高于PBS組（P<0.05）；
　　 8.用4.5LD50攻擊小鼠，各組21天生存率分別為：蛋白組生存率達(dá)42％；質(zhì)粒/腺

14、病毒組生存率為33％；蛋白/腺病毒組生存率為25％；腺病毒/蛋白組和腺病毒/質(zhì)粒組生存率為17％；腺病毒組和質(zhì)粒組生存率為8％；PBS組無存活。用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析表明，各組生存率曲線分布有差別（P<0.05），進(jìn)一步兩兩比較說明，蛋白組、質(zhì)粒/腺病毒組與PBS對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；蛋白組與質(zhì)粒組和腺病毒組比較有顯著差別（P<0.05）。
　　 9.與PBS對照組相比，各免疫組小鼠血中病毒滴

15、度顯著降低（P<0.05）；且蛋白/腺病毒組、腺病毒/蛋白組、蛋白組與腺病毒組相比血中病毒滴度顯著降低（P<0.05）；蛋白組與腺病毒/蛋白組相比血中病毒滴度也顯著降低（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功制備了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/VP1、CVB3VP1蛋白和重組腺病毒Ad/vp1。
　　 2.除PBS對照組外，各組血清中和抗體滴度、IgG抗體效價(jià)隨免疫次數(shù)的增加而提高。三次免疫后，蛋白/腺病毒組