Ⅰ群禽腺病毒的分離鑒定和生物學(xué)特性研究及重組禽腺病毒的構(gòu)建.pdf

1、腺病毒最早發(fā)現(xiàn)于1953年，由于它們傾向于感染上皮細胞而被命名為腺病毒。腺病毒屬腺病毒科(Adenoviridae)，共分為四個屬即哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus)、禽腺病毒屬(Aviadenovirus)、腺胸腺病毒屬(Atadenovirus)和唾液腺病毒屬(Siadenovirus)。禽腺病毒是禽類常見的病毒之一，大部分在禽體內(nèi)復(fù)制卻不致病，少數(shù)引起輕微的病癥。對禽腺病毒的流行和變異國外有很多研究工作，國內(nèi)的報道較

2、少。 腺病毒作為載體，宿主范圍廣，致病性低，在機體內(nèi)復(fù)制不發(fā)生整合，安全性高；能方便，載體疫苗可經(jīng)口服途徑接種。因此以腺病毒作為病毒載體具有獨特的優(yōu)勢。許多學(xué)者在禽類腺病毒載體方面做了很多研究工作，國內(nèi)研究較晚，但是所研制的基因工程疫苗離臨床應(yīng)用還有一定距離。目前，對禽腺病毒載體研究主要使用CMV啟動子，獲得了較好的表達效果，也有使用病毒自身的晚期啟動子／先導(dǎo)序列(MLP／LS)的報道，但是尚未見到對兩個啟動子的重組病毒的免疫效

3、果進行比較的報道。 本研究從外表健康禽群中隨機采取泄殖腔拭子，根據(jù)禽腺病毒CELOV的全序列設(shè)計引物，PCR擴增了病毒基因組右末端1.5Kbp的ITR片段。結(jié)果表明：禽腺病毒在禽群中的流行比較廣泛，雞群的陽性率為23.8％(30／1.26)，鴨群的陽性率為51.7％(15／29)，鵝群的陽性率為17.3％(10／58)。從雞源、鴨源、鵝源ITR擴增陽性的樣品中各選取3株，將ITR片段的PCR擴增產(chǎn)物克隆測序，并與CELOV、FA

4、V-9、EDSV以及FAV-JS株的相應(yīng)序列進行了比較。結(jié)果表明：本次分離的9株禽腺病毒與血清l型的代表株CELOV和我們實驗室早期分離株FAV-JS株在ITR片段上的同源性最高可達99.9％，最低也為94.7％：而與D亞群的FAV-9和禽腺病毒Ⅲ群的EDSV相比較，同源性較低。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的CELOV的全基因組序列設(shè)計了引物，對分離株的保守序列ORF8進行了擴增和序列測定工作，結(jié)果表明所有分離株、CELOV、FAV-9、E

5、DSV以及FAV-JS株的ORF8片段均具有高度同源性，符合腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)特征。根據(jù)以上序列分析結(jié)果，本研究證明了這些分離到的禽腺病毒屬于Ⅰ群禽腺病毒。同時，禽腺病毒在雞群、鴨群、鵝群中非常普遍，有必要對這些病毒的生物學(xué)特性進行研究。 為了更好的了解分離株的生物學(xué)特性以便探討其作為活病毒疫苗載體的可能性，通過病毒凝集實驗、電鏡形態(tài)觀察、細胞病變、動物攻毒實驗等方法對上述疑為I群禽腺病毒3個分離株進行了研究。電鏡觀察病毒粒子，

6、結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒為球型、無囊膜，直徑為70-80nm，具有腺病毒典型的二十面體結(jié)構(gòu)。紅細胞凝集試驗證明，分離到的病毒均不能凝集雞的紅細胞，與Ⅰ群禽腺病毒的特征一致。細胞培養(yǎng)表明：病毒分離株不能引起雞胚成纖維細胞(CEF)的細胞病變，而在雞胚腎細胞(CEK)上可以產(chǎn)生典型的禽腺病毒的細胞病變，表現(xiàn)為細胞變圓，折光性增強等病變。雞胚接種試驗未見明顯肉眼可見的病變，雞胚生長發(fā)育正常，這與Ⅰ群禽腺病毒分離株CELOV的特性不完全一致。 通過

7、大劑量皮下注射和口服兩種途徑接種1日齡的SPF雞，進行人工致病性試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗雞在感染病毒后，未出現(xiàn)任何明顯臨床癥狀。在10日齡時，皮下注射和口服攻毒的小雞的體重都明顯輕于對照組，而在20、30日齡時，各組和健康對照組之間體重沒有明顯差異，表明該分離株對SPF雞的體重影響不大，呈一過性。在10日齡時，攻毒組小雞主要免疫器官重量略低于對照組，實驗后期各組免疫免疫器官的重量基本一致。組織病理學(xué)切片觀察結(jié)果表明，部分臟器有輕微病變，大部

8、分臟器基本沒有病變，后期組織器官均正常。這表明該病毒對免疫器官沒有明顯的生長抑制和可見的病理損傷。以上體內(nèi)外實驗均表明病毒分離株致病性低，生物安全性高，可能是較好的禽腺病毒載體。 前期研究中篩選了FAV-JS的復(fù)制非必需區(qū)，將CMV調(diào)控外源基因表達的表達盒插入的禽腺病毒FAV-JS株左右臂構(gòu)建了通用轉(zhuǎn)移載體pFACMV3.1。在此研究基礎(chǔ)上，從本實驗室分離的所有禽腺病毒中選擇FAV-JS進行重組禽腺病毒的構(gòu)建。本研究根據(jù)CELO

9、V全基因序列設(shè)計引物，從FAVI-JS基因組中PCR擴增出腺病毒的主要晚期啟動子(MLP)，將擴增產(chǎn)物克隆測序，并與CELOV的MLP進行了序列比較，兩者同源性為99％。在此基礎(chǔ)上，將FAVI-JS株MLP片段克隆至pcDNA3.1／zeo(+)，然后再將pFACMV3.1中含有部分L片段和完整R片段的L＃-R片段克隆至同一pcDNA3.1／zeo(+)中，隨后將含有MLP片段、部分L片段和完整R片段的大片段克隆至pFACMV3.1，將

10、pFACMV3.1中的CMV啟動子替換為MLP啟動子，而其它部分不變，從而構(gòu)建了MLP啟動子控制的通用轉(zhuǎn)移載體pFAMLP 3.1。在此基礎(chǔ)上插入eGFP報告基因，構(gòu)建了MLP啟動子控制表達eGFP的正向轉(zhuǎn)移載體pFAMLP-eGFP，以用于重組病毒的構(gòu)建。將構(gòu)建的pFAMLP-eGFP轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染原代雞胚腎細胞(CEK)細胞，證實所克隆的MLP啟動子具有啟動子活性。在此研究基礎(chǔ)上，將pFAMLP-eGFP轉(zhuǎn)染已被wtFAVI-JS分離