禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒和禽痘病毒間基因天然重組的研究.pdf

1、為闡明我國(guó)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(Reticuloendotheliosisvirus，REV)天然整合進(jìn)禽痘病毒(Fowlpoxvirus，F(xiàn)PV)基因組的普遍性，對(duì)5株FPV疫苗株和4株分離的野毒株進(jìn)行調(diào)查研究。主要方法包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，斑點(diǎn)雜交(Dot-blot)，間接免疫熒光分析(IFA)等。IFA用以鑒定是否有游離病毒的污染，PCR和Dot-blot用以鑒定FPV中是否有REV片段整合。通過(guò)標(biāo)記探針，進(jìn)行Dot

2、-blot，快速方便適宜于多個(gè)樣品的檢測(cè)，設(shè)計(jì)來(lái)自REV的特異于基因LTR,env，pol,gag引物各一對(duì)，擴(kuò)增并測(cè)序比較，PCR擴(kuò)增測(cè)序更準(zhǔn)確。二者各有自身的優(yōu)點(diǎn)，因此結(jié)合應(yīng)用。結(jié)果表明，9株FPV均有REV-LTR和REV-env的整合，未檢測(cè)到REV-pol和REV-env，REV基因組片段整合進(jìn)FPV在我國(guó)FPV疫苗株及野毒株的現(xiàn)象已非常普遍。 參照國(guó)外發(fā)表的REV5’長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)在FPV疫苗株基因組上的整

3、合位點(diǎn)及相關(guān)序列，合成一對(duì)來(lái)自FPV的引物，從國(guó)內(nèi)5個(gè)不同廠家生產(chǎn)的禽痘疫苗中經(jīng)PCR均擴(kuò)增到REV-5’LTR。通過(guò)序列比較發(fā)現(xiàn)，我國(guó)5個(gè)FPV疫苗毒株中REV-5’LTR整合位點(diǎn)與美國(guó)和澳大利亞的天然重組禽痘疫苗完全一致。其中，有3個(gè)的REV-5’LTR插入序列也與美國(guó)的Vac-3-Am株和澳大利亞的Vac-M3-Au株有100％的同源性。另2個(gè)中國(guó)疫苗毒株中的REV-LTR插入序列與美國(guó)疫苗毒株Vac-1-Am中的REV-LTR插

4、入序列有99.6％的同源性。這5個(gè)中國(guó)禽痘疫苗毒株中整合的REVLTR與我國(guó)近年分離到的REV野毒株HA9901的5’LTR的同源性只有75.4％～92.4％。 應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)，IFA，Dot-blot和PCR等方法，經(jīng)過(guò)對(duì)不同地區(qū)分離的4株FPV田間分離株研究發(fā)現(xiàn)，其中3株檢測(cè)到有REV基因成分長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)和囊膜糖蛋白(env)基因片斷的整合，而另外1株LY-1整合有REV的4種基因成分LTR,env,pol,gag

5、片段。進(jìn)一步通過(guò)PCR方法，以9對(duì)來(lái)自REV的前后重疊的引物擴(kuò)增整合進(jìn)這株FPV中的REV全基因組cDNA序列片段。將9個(gè)序列拼接表明，LY-1的REV(命名為FPV-C-REV)全長(zhǎng)7889bp,與1997年澳大利亞學(xué)者發(fā)現(xiàn)的禽痘疫苗FPV-S株中整合的REV序列同源性92％，他們都缺失REV的3'LTR，而且LY-1還缺失REV-gag約80bp。用LY-1人工接種SPF雞，檢測(cè)到REV抗體陽(yáng)性，但是沒(méi)有檢測(cè)到REV病毒粒子。通過(guò)合

6、成2對(duì)上下游分別來(lái)自FPV和REV的異源引物FPV-R、FPV-E,其中FPV-R指5’端引物來(lái)自3'FPV，而3’端引物來(lái)自REV的5'LTR；FPV-E指3’端引物來(lái)自5'FPV，而5，端引物來(lái)自REV的env。PCR擴(kuò)增測(cè)序發(fā)現(xiàn)野毒株LY-1的REV整合位點(diǎn)都在FPV的開(kāi)放閱讀框(openreadingframe,ORF)201-203區(qū)，在FPV基因組的232469bp和232602bp間。根據(jù)上述結(jié)果推測(cè)，F(xiàn)PV野毒株LY-1