豬圓環(huán)病毒Ⅱ型CAP基因與Il-18基因重組禽痘病毒的構(gòu)建.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcinecircorirus，PCV)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病毒，其基因組為單股環(huán)狀DNA，病毒粒子無囊膜，呈二十面體對(duì)稱。PCV可劃分為PCV1和PCV2兩種基因型，其中PCV1基因組全長(zhǎng)1759bp，無致病性，但廣泛存在于豬體和豬源細(xì)胞系，首先由Tischer于PK-15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)；PCV2基因組長(zhǎng)1767bp或1768bp，被認(rèn)為是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaningmultisystemi

2、cwastingsyndrome，PMWS)的主要病原。PCV2有兩個(gè)主要的開放閱讀框(ORF)：ORF1和ORF2，ORF2基因編碼該病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，是區(qū)分PCV1和PCV2的重要區(qū)域。我國(guó)于2000年首次發(fā)現(xiàn)了PCV2的存在，該病毒在我國(guó)豬場(chǎng)中感染率高，豬群的平均陽性率一般都大于20％，有的甚至超過50％，有些地區(qū)高達(dá)100％，可以說目前該病毒已在我國(guó)豬群中普遍存在，每年因PCV2感染造成經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)億元。
　　 為了構(gòu)建P

3、CV2CAP基因重組禽痘病毒，將其亞克隆到含有LP2EFP2早晚期啟動(dòng)子的載體pSY538的BamHI何點(diǎn)，將帶有痘曲病毒啟動(dòng)子P11的LacZ基因平端克隆到質(zhì)粒pSY681的SfiⅠ位點(diǎn)，然后切下含有LP2EP2啟動(dòng)子的CAP片段再亞克隆到禽痘病毒載體pSY681的NotⅠ位點(diǎn)，用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染已感染親本禽痘病毒S-FPV-017株的雞胚成纖維細(xì)胞，在含有x-gal的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)斑篩選，獲得重組病毒rFPV-CAP，通過PC

4、R和酶切進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明獲得包含有PCV2CAP基因的禽痘病毒并且具有穩(wěn)定的遺傳性狀。以間接免疫熒光法證實(shí)感染rFPV-CAP的CEF中存在表達(dá)的CAP蛋白，為研發(fā)PCV2病毒重組禽痘病毒疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　 共表達(dá)PCV2CAP基因與豬IL-18基因的重組禽痘病毒的構(gòu)建，將含有LP2EP2啟動(dòng)子的IL-18基因克隆至含有CAP基因的重組禽痘病毒rFPV-S1的上游，用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染已感染親本禽痘病毒S-FPV-017株的雞

5、胚成纖維細(xì)胞，在含有x-gal的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)斑篩選，獲得重組病毒rFPV-CAP-IL-18，通過PCR和酶切進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明獲得包含有PCV2CAP基因和IL-18的重組禽痘病毒并且具有穩(wěn)定的遺傳性狀。以間接免疫熒光法證實(shí)感染rFPV-CAP-IL-18的CEF中存在表達(dá)的CAP蛋白。為開發(fā)利用IL-18的佐劑效應(yīng)及構(gòu)建共表達(dá)IL-18基因和保護(hù)性抗原基因的重組禽痘病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究成功獲得了PCV2