Ⅰ群禽腺病毒核酸檢測(cè)方法及DNA疫苗的研究.pdf

1、I群禽腺病毒屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬主要包括12個(gè)血清型，各血清型毒株之間含有相同的群特異性抗原，雞胚致死孤兒病毒、雞包涵體肝炎病毒等為I群禽腺病毒中較為常見的毒株。不同日齡的家禽和野生鳥類均可感染I群禽腺病毒，引起典型的臨床癥狀如：包涵體肝炎、貧血和生產(chǎn)能力下降，給養(yǎng)禽業(yè)帶來極大危害。[1]。
　　 利用兩對(duì)引物分別對(duì)I群禽腺病毒的12個(gè)血清型毒株的hexon基因的A、B兩個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增。其中A片段大小為1219bp，B片段為

2、1350bp。通過對(duì)所擴(kuò)增片段的序列和限制性酶切位點(diǎn)分析，選擇限制性內(nèi)切酶Hae II對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切片段多態(tài)性分析。結(jié)果，本研究所擴(kuò)增的I群禽腺病毒的12個(gè)血清型毒株的目的片段，其酶切片段呈現(xiàn)多態(tài)性。表明該限制性內(nèi)切酶能對(duì)I群禽腺病毒的12個(gè)血清型進(jìn)行分型。
　　 根據(jù)I群禽腺病毒hexon基因保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)一套特異性LAMP引物，建立了一種適用于I群禽腺病毒的LAMP快速檢測(cè)方法。結(jié)果表明該方法可以特異的擴(kuò)增出I群禽腺病

3、毒的12個(gè)血清型標(biāo)準(zhǔn)毒株，對(duì)構(gòu)建的I群禽腺病毒質(zhì)粒DNA最小檢測(cè)限可達(dá)lxl01拷貝/μL;LAMP方法對(duì)臨床樣品的檢出率高于PCR方法；在擴(kuò)增產(chǎn)物中添加SYBR Green I染料后可通過肉眼觀察有無熒光產(chǎn)生而對(duì)結(jié)果進(jìn)行直接判定。本研究建立的LAMP方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異性高，可作為I群禽腺病毒感染的快速診斷方法。
　　 利用針對(duì)I群禽腺病毒（AAV）檢測(cè)的普通PCR，半巢式PCR，Real-timePCR，和LAMP四種

4、核酸檢測(cè)方法對(duì)不同質(zhì)粒濃度的樣品和臨床疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較四種核酸檢測(cè)方法的敏感度。并與與傳統(tǒng)的病毒分離方法進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果四種核酸檢測(cè)方法中Real-time PCR最為敏感，可以檢測(cè)到1xlOO拷貝/μL，LAMP與半巢式PCR其次可以檢測(cè)到1×101拷貝/μL，普通PCR只能檢測(cè)到1xl03拷貝/μL。結(jié)合臨床疑似病料檢出結(jié)果表明在實(shí)踐中根據(jù)實(shí)際情況需要選擇合適的檢測(cè)法對(duì)I群禽腺病毒(AAV)進(jìn)行檢測(cè)是十分必要的。
　　

5、將I群禽腺病毒CELO株的hexon基因與雞IL-2基因進(jìn)行連接，將融合基因克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pcDNA3.1中構(gòu)建了pcDNA3.1-hexon-Linkcr-ChIL2融合基因重組真核表達(dá)載體。并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，通過RT-PCR、免疫熒光試驗(yàn)對(duì)重組質(zhì)粒的體外瞬時(shí)表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)鑒定。檢測(cè)結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-hexon-Linker-ChlL2融合基因重組載體，并在Vero細(xì)胞中獲得表達(dá)。
　　

6、 將重組載體pcDNA3.1-hexon-Linker-ChIL2大量純化后，通過胸部肌肉多點(diǎn)注射的方法免疫三周齡SPF雞，每只雞200μg。同時(shí)設(shè)立pcDNA3.1-hexon組，滅活苗對(duì)照組，空載體對(duì)照組，及空白對(duì)照組。免疫后每周采血一次，ELISA方法檢測(cè)抗體水平。于第5周進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，并于攻毒后的3天，5天，7天，14天采集各組雞的肛門綿拭子，檢測(cè)排毒情況。結(jié)果顯示pcDNA3.1-hexon-Linker-ChlL2組，滅活苗

7、組的抗體水平要明顯高于其它組能更好的抑制排毒。
　　 為了研究免疫DNA疫苗以后其在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布情況、在各組織的出現(xiàn)和消失時(shí)間。用pcDNA3.1-hexon-Linker-ChIL2質(zhì)粒對(duì)3周齡的SPF雞進(jìn)行胸肌多點(diǎn)注射，每只雞200ug，接種后的不同時(shí)間分別對(duì)雞的心，肝臟，脾臟，肺，腎臟，胸腺，法氏囊，腸，接種部位肌肉以及血液采用Real-time-PCR和半巢式PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果在接種DNA疫苗1～3小時(shí)以后血液中