1、新孢子蟲病是由犬新孢子蟲引起牛和其它動物的重要的原蟲病，該病可引起牛的流產(chǎn)、死胎及神經(jīng)系統(tǒng)障礙疾病，已給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。對新孢子蟲病的防控目前尚無有效的方法。目前，以病毒為載體的疫苗得到了廣泛研究，其中腺病毒載體疫苗在寄生蟲領(lǐng)域也得到了應(yīng)用且卓見成效，而以DNA疫苗初免、病毒載體疫苗加強免疫的策略在誘導接種動物體液免疫和細胞免疫方面顯示了良好的效果。
本試驗根據(jù)GenBank中（AB265823.1）已公布的犬新孢
2、子蟲AMA1基因序列，設(shè)計并合成擴增 AMA1基因的兩對特異性引物，應(yīng)用 RT-PCR方法對牛源犬新孢子蟲吉林株AMA1基因進行擴增，將擴增的AMA1基因克隆至pMD18-T simple載體，將測序正確的AMA1基因分別亞克隆至 pVAX-1真核表達載體與pCR259腺病毒穿梭載體。將構(gòu)建的pVAX1-AMA1真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Vero細胞進行表達，并通過間接免疫熒光和western blot檢測其表達產(chǎn)物，之后通過質(zhì)粒中提試劑盒大提p
3、VAX1-AMA1質(zhì)粒，制備核酸疫苗。同時將構(gòu)建的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pCR259-NcAMA1依次轉(zhuǎn)化HighQ-1 Transpose-Ad294和HighQ-1感受態(tài)細胞，構(gòu)建并純化犬新孢子蟲 AMA1基因重組腺病毒表達質(zhì)粒294-AMA1。通過脂質(zhì)體將線性化的294-AMA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至QBI-HEK293細胞以包裝 Ad5-NcAMA1重組腺病毒。通過 IFAT和 Western blot檢測犬新孢子蟲AMA1基因在QBI-HEK
4、293細胞中的表達。獲得的Ad5-NcAMA1病毒滴度為5.62×109/mL，大量擴增、純化后制備重組腺病毒載體疫苗。
應(yīng)用制備的核酸疫苗和腺病毒疫苗，按照Prime-Boost免疫組、Ad5-NcAMA1重組腺病毒免疫組、pVAX1-AMA1核酸疫苗組及PBS對照組對BALB/c小鼠進行免疫接種。通過間接 ELISA測定小鼠 IgG、IgG1及 IgG2a抗體水平；通過ELISA試劑盒檢測 IFN-γ與 IL-4細胞因子水
5、平；通過流式細胞儀檢測小鼠的CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群變化。
結(jié)果顯示，擴增的牛源犬新孢子蟲吉林株 AMA1基因大小為1695 bp，與GenBank中AMA1基因（AB265823.1）核苷酸同源性為99.9％，氨基酸同源性為99.8%。構(gòu)建的pVAX1-AMA1真核表達質(zhì)粒及重組腺病毒質(zhì)粒均可在真核細胞內(nèi)表達，表達蛋白分子量約為68 kDa。BALB/c小鼠接種分析表明，Prime-Boost免疫組 IgG抗體水平均
6、極顯著高于 pVAX1-AMA1核酸疫苗組（P<0.01)與Ad5-NcAMA1免疫組（P<0.01)；Prime-Boost免疫組 IgG1水平顯著高于Ad5-NcAMA1免疫組（P<0.05)與pVAX1-AMA1核酸疫苗組（P<0.05)；Prime-Boost免疫組 IgG2a抗體水平顯著高于 pVAX1-AMA1核酸疫苗組（P<0.05)，與Ad5-NcAMA1免疫組差異不顯著。Prime-Boost免疫組IL-4水平顯著高于
7、病毒免疫組 Ad5-NcAMA1（p<0.05），極顯著高于 pVAX1-AMA1免疫組（p<0.01）；Prime-Boost免疫組IFN-γ水平顯著高于pVAX1-AMA1核酸疫苗組（P<0.05)，與病毒免疫組Ad5-NcAMA1差異不顯著。CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群分析表明，Prime-Boost免疫組 CD4+均顯著高于 Ad5-NcAMA1免疫組（P<0.05)與pVAX1-AMA1核酸疫苗組（P<0.05)；CD4+
