EBV-LMP2的DNA疫苗、AAV疫苗以及腺病毒疫苗聯(lián)合免疫效果的研究.pdf

1、Epstein-Barr(EB)病毒與多種人類的惡性腫瘤相關(guān)，鼻咽癌是其中之一，在我國南方一些省(自治區(qū))發(fā)病率可高達(dá)10～50/10萬/年，成為我國重點防治的十大腫瘤之一。雖然放療及放療聯(lián)合化療對很多病例有效，但仍有大約30％的病人難以控制。EBV在癌細(xì)胞中的存在為以CTL為基礎(chǔ)進(jìn)行鼻咽癌的免疫治療提供了良好的靶位，成為傳統(tǒng)治療方法的有益補充。鼻咽癌的腫瘤細(xì)胞EBV處于Ⅱ型隱性感染狀態(tài)，表達(dá)EBNAl,LMPl和LMP2蛋白。LMP2

2、在腫瘤細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)，無致癌性，具有潛在的HLA限制的細(xì)胞激活表位，能良好的誘導(dǎo)CTL發(fā)揮作用，成為公認(rèn)的治療NPC較理想的靶抗原。
　　 本課題組在科室長期從事鼻咽癌的早期診斷及疫苗研究工作的基礎(chǔ)上，致力于鼻咽癌的治療性疫苗的研究。左建民等成功構(gòu)建了攜帶EBV-LMP2基因的非復(fù)制5型重組腺病毒(rAd-LMP2)，該病毒可以在細(xì)胞內(nèi)以內(nèi)源蛋白的方式表達(dá)LMP2蛋白。王湛等對其進(jìn)行了免疫效果研究，研究表明免疫恒河猴后能有效的

3、誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)。腺病毒載體宿主范圍廣泛，對分裂期細(xì)胞、靜止或終末分化細(xì)胞都有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，可在細(xì)胞內(nèi)短期高水平表達(dá)目的基因，但腺病毒載體具有極高的免疫原性，免疫劑量及免疫次數(shù)增加都會顯著增加腺病毒中和抗體的滴度，影響了目的基因的有效運輸，對希望達(dá)到高效的免疫治療效果會產(chǎn)生一定的影響。研究表明，用DNA疫苗或者一種載體疫苗初免后，用另一種載體疫苗加強免疫動物，與單一的疫苗免疫動物相比，能誘導(dǎo)更強的免疫應(yīng)答。因此，我們擬構(gòu)建另兩種疫

4、苗，DNA疫苗和重組腺相關(guān)病毒疫苗。DNA疫苗具有易于構(gòu)建和改造、成本低廉、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點，通過在體內(nèi)表達(dá)目的抗原而引起特異性免疫反應(yīng)，可以激發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫，尤其能更好的誘導(dǎo)特異性CTL。重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體宿主范圍廣，安全性好、物理性質(zhì)穩(wěn)定，具有極低的免疫原性和較長時期的基因表達(dá)能力，成為很有前景的用于疫苗的載體。鑒于以上背景，本研究在課題組以往從事的rAd-LMP2研究的基礎(chǔ)上，制備DNA疫苗pVR-LMP2，重組

5、腺相關(guān)病毒疫苗rAAV2/1-LMP2，幾種疫苗聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)揮各自的優(yōu)勢，以期達(dá)到單一疫苗難以達(dá)到的效果。
　　 構(gòu)建了DNA疫苗pVR-LMP2，酶切及測序結(jié)果表明LMP2基因正確插入pVR質(zhì)粒載體中，間接免疫熒光實驗及Western Blot法檢測確認(rèn)了LMP2在293細(xì)胞中能有效表達(dá)。
　　 構(gòu)建了重組AAV表達(dá)質(zhì)粒pSNAV-LMP2，并建立了rAAV2/1-LMP2的生產(chǎn)細(xì)胞株BHK-LMP2，最終制備及純化了

6、AAV疫苗rAAV2/1-LMP2。電鏡觀察及SDS-PAGE分析顯示我們得到了高純度的重組病毒rAAV2/1-LMP2，感染性檢測表明rAAV2/1-LMP2能感染293細(xì)胞并能有效表達(dá)LMP2蛋白。
　　 將制備及純化的pVR-LMP2、rAAV2/1-LMP2及本課題組已經(jīng)制備好的rAd-LMP2，單獨及幾種聯(lián)合免疫BalB/C小鼠，2周間隔，免疫三次，末次免疫后一周取脾淋巴細(xì)胞，IFN-γELISPOT檢測特異CTL水平

7、。結(jié)果表明pVR-LMP2、rAAV2/1-LMP2及rAd-LMP2單獨免疫，組平均數(shù)分別為50個斑點形成細(xì)胞/106淋巴細(xì)胞、110個斑點形成細(xì)胞/106淋巴細(xì)胞、368個斑點形成細(xì)胞/106淋巴細(xì)胞，明顯低于聯(lián)合免疫組。在聯(lián)合免疫組中，pVR-LMP2免疫兩次，rAd-LMP2最后加強一次，組平均數(shù)為928個斑點形成細(xì)胞/106淋巴細(xì)胞，高于pVR-LMP2免疫一次，rAd-LMP2加強免疫兩次組(組平均數(shù)為770個斑點形成細(xì)胞/

8、106淋巴細(xì)胞)，可能是rAd-LMP2免疫一次后產(chǎn)生的腺病毒中和抗體封閉了再次的腺病毒載體，導(dǎo)致第二次的rAd-LMP2免疫不能很好的發(fā)揮作用。pVR-LMP2、rAAV2/1-LMP2和rAd-LMP2各免疫一次組的免疫效果最好，組平均數(shù)為1024個斑點形成細(xì)胞/106淋巴細(xì)胞，其中最高一只小鼠達(dá)到了1202個斑點形成細(xì)胞/106淋巴細(xì)胞。
　　 總之，我們成功構(gòu)建了DNA疫苗pVR-LMP2和重組腺相關(guān)病毒疫苗rAAV2/