表達(dá)HIV-Ⅰ多價(jià)野生基因和合成基因重組痘苗病毒疫苗株的構(gòu)建及與DNA疫苗聯(lián)合免疫效果的研究.pdf

1、該研究的目的是基于中國(guó)HIV-1主要流行株B'/C重組株CN54,構(gòu)建兩株不帶篩選標(biāo)記的多價(jià)重組痘苗病毒疫苗株,并與相應(yīng)的DNA疫苗聯(lián)合免疫BALB/c小鼠,從而探討其誘發(fā)的HIV特異性免疫應(yīng)答.同時(shí)設(shè)立平行實(shí)驗(yàn)組,比較HIV密碼子優(yōu)化的合成基因野生型基因誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答之間是否存在差異,為中國(guó)艾滋病疫苗的臨床試驗(yàn)提供參考.該實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了含有neo基因和lacZ基因雙重篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVI75將HIV-I中國(guó)主要流行株

2、B'/C重組株CN54 gagpol基因置于pVI75的啟動(dòng)子pE/L下,構(gòu)建重組質(zhì)粒pVI75-gagpol;將HIV合成抗原基因syngpnef和syngpl20分別克隆到pVI75的啟動(dòng)子pE/L下游,構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVI75-syngpnef-syngpl20.重組質(zhì)粒在雞胚細(xì)胞內(nèi)與痘苗病毒發(fā)生同源重組,使HIV目的基因與含neo基因和lacZ基因的雙重篩選標(biāo)記一同重組到痘苗病毒基因組DNA的TK區(qū)中.結(jié)果顯示,成功篩選到了

3、兩株重組痘苗病毒,分別命名為rVV-gagpol和rVV-syngpnef-syngp120.經(jīng)PCR和Dot blot檢測(cè),確認(rèn)這兩株重組痘苗病毒的neo基因和lacZ基因均已丟失;PCR鑒定表明目的基因已插入重組痘苗病毒的基因組中;抗體染色和Western blot結(jié)果證實(shí)這兩株重組痘苗病毒都能很好的表達(dá)HIV目的蛋白.免疫策略是影響免疫效果的重要因素之一.該實(shí)驗(yàn)采用DNA疫苗初免,重組疫苗病毒加強(qiáng)的Prime-boost免疫策略.

4、先用相應(yīng)的DNA疫苗免疫3次,再用所構(gòu)建的重組痘苗病毒加強(qiáng)免疫1次,比較各實(shí)驗(yàn)組小鼠誘導(dǎo)的可能免疫應(yīng)答情況,同時(shí)進(jìn)一步分析比較免疫含HIV野生型抗原基因和合成抗原基因的疫苗后,在小鼠中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是否存在差異.間接ELISA法測(cè)定Gag和Env特異性結(jié)合抗體;間接ELISA法檢測(cè)Gag特異性IgG2a/IgG1,以確定誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)分泌IFN-γ的HIV-1特異性CD8<'+> T淋巴細(xì)胞,以評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫反應(yīng)

5、水平.結(jié)果顯示,各實(shí)驗(yàn)組小鼠均誘導(dǎo)了較強(qiáng)的HIV特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,并且傾向Th1型的細(xì)胞免疫應(yīng)答.帶有野生型抗原基因的gagpol組誘導(dǎo)出了較高的體液免疫應(yīng)答,帶有合成抗原基因的syngpnef-syngp120組誘導(dǎo)出了較高的細(xì)胞免疫應(yīng)答.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,各組之間都不存在顯著性差異.綜上所述,該研究成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pVI75.通過該質(zhì)粒載體所建立的重組痘苗病毒疫苗株篩選平臺(tái)具有工作量小、周期短等優(yōu)點(diǎn),大大提高了中國(guó)HIV

6、活載體候選疫苗的研制效率.通過該平臺(tái),該研究成功構(gòu)建了兩株不帶篩選標(biāo)記的多價(jià)重組痘苗病毒疫苗株rVV-gagpol和rVV-syngpnef-syngp120,分別表達(dá)HIV-1中國(guó)主要流行株B'/C重組株CN54的野生型抗原基因和合成抗原基因,為中國(guó)艾滋病疫苗的臨床試驗(yàn)提供重要候選疫苗.動(dòng)物免疫結(jié)果說明,rVV-gagpol和rVV-syngpnef-syngp120與相應(yīng)的DNA疫苗聯(lián)合免疫小鼠,能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,為