利用重組工程技術構建多價DNA疫苗載體及大腸桿菌活菌疫苗載體的分析比較.pdf

1、疾病預防的有效途徑之一是接種疫苗,繼第一代減毒或無毒疫苗和第二代亞單位疫苗之后出現(xiàn)了第三代DNA疫苗。疫苗效果在很大程度上依賴于輸送抗原的載體。為研究更有效的疫苗載體形式,本研究應用噬菌體Red重組酶介導的新型重組工程技術,構建了多價DNA疫苗載體前體及攜帶禽流感病毒抗原基因的多價DNA疫苗載體,為了更好的輸送多價DNA疫苗,探索構建了具有哺乳動物上皮細胞黏附能力的無毒性重組大腸桿菌活菌疫苗菌株。
　　 在本室前期工作基礎上,本

2、實驗應用如下Red重組工程系統(tǒng)及技術:①大腸桿菌染色體上Red重組系統(tǒng)及kan-sacB選擇反選擇篩選方法②pKD46重組系統(tǒng)及kan-kil選擇反選擇篩選方法③pYM-Red重組系統(tǒng)及Gap-Repair缺口修復技術,進行染色體上基因的無痕敲入、替換及質粒構建。本實驗解決基因融合打靶問題時,在重組技術上有創(chuàng)新應用,利用Red重組酶工作原理,將外源片段體外重疊PCR法制備改為片段體內重組融合,片段融合及重組均在體內完成,省略了體外PCR

3、的步驟加快實驗進程。
　　 以pcDNA3.1(-)B為基礎,以酶切連接方法構建了四價DNA疫苗載體pWYⅠ-Ⅱ-Ⅲ-Ⅳ,瞬時轉染實驗證明其具有蛋白表達能力,真核表達的多價DNA疫苗載體構建成功,可用于攜帶多價抗原基因,避免了多質粒操作帶來的不便。然后利用重組技術試圖將禽流感病毒基因組抗原基因HA頭部、NA全長分別加載到其Ⅰ、Ⅱ位,構建二價DNA疫苗。
　　 將南美錐蟲(trypanosome cruzi)gp82基因的

4、P4及P8 DNA區(qū)段融合構建成P4/8基因片段,將其敲入大腸桿菌染色體的外膜蛋白LamB基因內形成融合蛋白,并展示在細胞外膜上,構建出帶有細胞黏附能力的E.coli DY330 P4/8<>lamb菌株。通過體外黏附實驗證明,以前構建的E.coli DY330 P4<>lamb比新構建的E.coli DY330 P4/8<>lamb菌株黏附哺乳動物上皮細胞的能力要強；同時體外細胞毒性實驗證明DY330.P4<>lamb菌株安全性良好,

5、可做為活菌疫苗載體的候選株進行深入研究。
　　 研究表明,重組工程技術在構建多種形式疫苗載體中具有靈活性及有效性,構建的多價DNA疫苗載體具備通用性,可以加載多種抗原基因的組合,作為快速制備疫苗的模板,有效應對突發(fā)疫情；構建的黏附性活菌疫苗載體可以攜帶DNA疫苗,也可以直接在染色體上攜帶抗原基因,高效運送抗原基因或蛋白。在應用中不斷嘗試各種構建方案也使我們更深入理解了重組酶工作原理,希望通過技術的拓展加速疫苗的研制與開發(fā)進程,為