豬繁殖與呼吸綜合征雙基因及佐劑活病毒載體疫苗與DNA疫苗研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以妊娠母豬嚴重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病。PRRS自1987年首次報道發(fā)現于美國以來，現已遍及世界各主要養(yǎng)豬國家與地區(qū)，并已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的傳染病之一。同其它多數病毒病的防制一樣，免疫接種仍是預防與控制PRRS的主要措施。目前用于預防PRRS的主要商用疫苗是傳統(tǒng)常規(guī)疫苗弱毒疫苗和滅活疫苗。但已證實弱毒苗存在散毒及高幾率毒力返強

2、的安全隱患，國外許多國家已禁用弱毒苗。滅活苗盡管安全性較好，但不僅需多次重復接種，而且免疫效果不理想，還經?？蓪е旅庖呤　Ｒ虼?，迫切需要更安全、高效、廉價的新型疫苗來預防和控制PRRS的發(fā)生與流行。 蛋白轉導是新近發(fā)展和建立起來的一種富有生命力的新技術。其高效的跨膜轉運功能和在細胞間自主傳遞的特點，為提高新型疫苗免疫效應提供了新的思路和有效手段。目前已證實具有獨特蛋白轉導特性的來源于a-皰疹病毒亞科的VP22同源物，能顯著提高

3、與之融合的外源蛋白的遞呈效率進而提高其免疫原性，并證實可顯著提高DNA疫苗或腺病毒載體疫苗的免疫效應，其中牛皰疹病毒1型(BHV-1)VP22是極具開發(fā)應用潛力的新型高效的蛋白轉導免疫增強佐劑分子。 鑒于此，本研究以PRRSV兩個最主要的保護性抗原基因…經修飾具有更好免疫原性的ORF5基因(ORF5M)以及ORF6基因為靶基因，以BHV-1 VP22為免疫增強佐劑分子，開展了以偽狂犬病毒(PRV)為載體的PRRS雙基因及佐劑活病

4、毒載體疫苗以及PRRS雙基因及佐劑DNA疫苗研究，主要研究內容如下： 1、雙基因及佐劑重組偽狂犬病毒TK<'->／gE<'->／VP22E<'+>／VP22M<'+>的構建與免疫反應 采用PCR方法從含：BHV-1 VP22基因及PRRSV ORFSM基因的質粒中，擴增到不含終止子的VP22基因以及ORF5M基因的完整編碼區(qū)，并進行了克隆和序列分析，經序列測定證實兩基因均未發(fā)生堿基突變。將ORF5M及VP22基因依

5、次插入到PRV通用轉移載體pIECMV中，構建了含VP22-ORF5M融合基因的PRV轉移質粒plECMV-VP220RF5M。再將與VP22基因融合的PRRSV ORF6基因表達盒插入到plECMV-VP220RF5M中，構建了含VP22-ORF5M與VP22-ORF6融合基因的PRV轉移質粒pIECMV-VP220RF5M-VP220RF6。采用脂質體介導法將轉移質粒與EcoRI線性化后的PRV gE基因缺失標記疫苗株TK<'->／

6、gE<'->／LacZ<'+>基因組共轉染IBRS-2細胞，出現細胞病變(CPE)的轉染產物經蝕斑純化結合PCR擴增篩選，構建了融合表達VP22與ORF5M基因的單基因及佐劑重組偽狂犬病毒(rPRV)TK<'->／gE<'->／VP22E<'+>，以及共表達與VP22融合的ORF5M與ORF6基因的雙基因及佐劑rPRVTK<'->／gE<'->／VP22E<'+>／VP22M<'+>，并經：PCR、Southern blot、Weste

7、rn blot、IFA證實構建正確，外源融合基因得到表達，并具有免疫學活性。而且外源基因的插入不影響rPRV在IBRS-2或PK-15細胞上的增殖。 2、PRRS雙基因及佐劑DNA疫苗pCI-VP22ORF5M-VP22ORF6的構建與免疫反應 將BHV-1 VP22基因以及PRRSV ORF5M基因依次插入到真核表達載體pCI-neo中，構建了融合表達VP22與ORF5M基因的單基因及佐劑DNA疫苗表達質粒pCI-VP

8、22ORFSM。再將VP22-ORF6融合基因表達盒插入到pCI-VP22ORF5M中，構建了共表達與VP22融合的ORF5M及ORF6基因的雙基因及佐劑DNA疫苗表達質粒pCI-VP22ORF5M-VP22ORF6，經IFA和Western blot證實，外源融合基因得到表達，并具有免疫學活性。將單/雙基因及佐劑DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，并與單/雙基因DNA疫苗pCI-ORF5M與pCI-ORF5M-ORF6進行比較。結果顯示，

9、4種DNA疫苗誘導體液及細胞免疫反應的能力從低到高順序均為：單基因DNA疫苗＜單基因及佐劑DNA疫苗＜雙基因DNA疫苗＜雙基因及佐劑DNA疫苗。其中，單基因及佐劑DNA疫苗誘導的ELISA抗體、中和抗體水平與淋巴細胞增殖反應與相應的單基因DNA疫苗相比差異均顯著。較之于單基因DNA疫苗，雙基因及佐劑DNA疫苗誘導的ELISA抗體和中和抗體均比雙基因DNA疫苗更為顯著。而且雙基因及佐劑DNA疫苗誘導的淋巴細胞增殖反應與相應的雙基因DNA疫