表達幽門螺桿菌鞭毛粘附素的重組大腸桿菌ghost型疫苗的制備及鑒定.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是一種定植于胃內(nèi)的革蘭氏染色陰性、螺桿狀或S狀的微需氧菌，可引發(fā)慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等上消化道疾病，并與胃癌、胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生有關。由于傳統(tǒng)的抗生素療法面臨著價格高、耐藥性等諸多問題，開發(fā)有效的Hp疫苗成為防治Hp感染的研究熱點。目前研發(fā)的Hp疫苗，多是采用基因工程獲得HP的有效抗原，再輔以佐劑，如福氏佐劑、CT、LT，脂質(zhì)A，但這些佐劑都只是非特異地加強抗

2、原的免疫效應。而傳統(tǒng)的滅活疫苗雖有好的保護作用，但是現(xiàn)用的加熱、照射、化學處理等滅活方法，常常引起抗原性的降低和改變。 “Bacterialghost”作為一種新型疫苗或抗原遞送系統(tǒng)，是通過控制PhiX174噬菌體E裂解基因在細菌中表達得以制備的，其實質(zhì)是一種無細菌胞漿和核酸的空細菌外膜。據(jù)報道，E裂解基因編碼的蛋白在細菌胞壁上可形成穿膜隧道，通過此隧道胞漿成分全部滲出。因為這種形式保留了和活菌一樣完整的細菌胞膜結(jié)構(gòu)和相關抗原蛋

3、白，故而能夠攜帶外源抗原靶向黏附于體內(nèi)黏膜組織并易于被相應抗原提呈細胞捕獲。Hp粘附于胃上皮細胞是其定植進而致病的前提，有效阻斷Hp粘附是防治Hp感染的途徑之一。現(xiàn)在認為幽門螺桿菌黏附素A(HpadhesionA,HpaA)是Hp的主要黏附因子，該蛋白為Hp所特有的抗原成分，其氨基酸序列高度保守，且多數(shù)Hp感染患者血清中能檢測到HpaA抗體，因此可作為理想的Hp疫苗靶抗原。 本課題嘗試用“Bacterialghost”這一新型疫

4、苗遞送形式和內(nèi)佐劑來傳輸HpaA抗原，擬構(gòu)建表達HpaA的重組大腸桿菌ghost疫苗，即先把HpaA錨定表達于大腸桿菌的胞膜，然后誘導細菌裂解以制備表達HpaA的重組大腸桿菌ghost。本研究中，在成功制備大腸桿菌ghost的基礎上，采用兩種技術(shù)路線制備表達HpaA的重組大腸桿菌ghost：一種為雙質(zhì)粒共表達法，即將含裂解基因盒的裂解質(zhì)粒pHH43和含hpaA表達盒的表達質(zhì)粒pBIOEX-E'-hpaA同時轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，先IPT

5、G誘導HpaA表達，再熱誘導E裂解蛋白表達以制備重組ghost；二為單質(zhì)粒雙表達法，即將裂解基因盒和hpaA表達盒構(gòu)建到同一質(zhì)粒pET-28a上，先IPTG誘導表達HpaA蛋白，再用熱誘導表達E裂解蛋白而獲得重組ghost。主要研究內(nèi)容簡述如下： 1.大腸桿菌ghost的制備及鑒定：將裂解質(zhì)粒pMuH36(含E裂解基因盒)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，經(jīng)熱誘導表達E裂解蛋白，通過監(jiān)測OD600來觀察細菌的裂解情況，獲得裂解曲線，并用

6、菌落計數(shù)的方法計算裂解率，達到95.07％；后經(jīng)透射和掃描電子顯微鏡鑒定大腸桿菌ghost的形態(tài)，證明成功制備了具有完整外膜的大腸桿菌ghost，為下一步實驗奠定了基礎。 2.HpaA在載體pET28a和pBIOEX的克隆與表達：用PCR從質(zhì)粒pMuH36中擴增膜錨定序列E'(裂解蛋白E的第1-54位氨基酸，已證明可錨定于細菌內(nèi)膜)，克隆到含有hpaA基因的質(zhì)粒pET28a-ltB-hpaA中，如此構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pET28a-

7、E'-hpaA，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導表達、SDS-PAGE電泳、免疫印跡鑒定HpaA蛋白的表達；在此基礎上，采用PCR自pET28a-E'-hpaA擴增E'-hpaA片段，構(gòu)建與ColE1相容性的重組質(zhì)粒pBIOEX-E'-HpaA，經(jīng)IPTG誘導表達、SDS-PAGE電泳、免疫印跡和ELISA法檢測。結(jié)果表明，酶切鑒定和測序結(jié)果與預期一致，目的蛋白E'-hpaA分子量約32KD左右，免疫印跡、ELIS

8、A均顯示目的蛋白具有與兔抗HpaA血清的免疫反應性，證實重組質(zhì)粒pET28a-E'-hpaA和pBIOEX-E'-HpaA構(gòu)建和表達成功。 3.雙質(zhì)粒共表達法制備重組大腸桿菌ghost：采用將裂解質(zhì)粒pHH43(含E裂解基因)和共相容質(zhì)粒pBIOEX-E'-hpaA共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，先用IPTG誘導hpaA的表達，然后再熱誘導細菌裂解形成表達有rHpaA的重組大腸桿菌ghost，進一步摸索不同誘導條件下的重

9、組大腸桿菌ghost裂解效率，用ELISA和間接免疫熒光方法檢測HpaA的膜表達，結(jié)果選擇OD600值到達0.4時開始加入1mmol/LIPTG誘導HpaA表達60min后再熱誘導細菌的裂解，4h后收集ghost，裂解率為97.23％。免疫熒光證實HpaA蛋白成功地錨定在大腸桿菌ghost的膜上。 4.單質(zhì)粒雙表達法制備重組大腸桿菌ghost：先將裂解質(zhì)粒pHH43上的E裂解基因盒(E-box)通過克隆到pET28a-E'-hp

10、aA，獲得雙表達重組質(zhì)粒pET28a-hpaA-E-box。同樣方法誘導HpaA表達并制備重組大腸桿菌ghost。結(jié)果選擇OD600值到達0.4時開始加1mmol/LIPTG誘導HpaA表達60min后再熱誘導細菌的裂解3h后收集ghost，裂解率為98.57％。免疫熒光證實HpaA蛋白成功地錨定在大腸桿菌ghost的膜上。 5.用上述兩種路線制備的重組大腸桿菌ghost的透射電鏡結(jié)果顯示裂解后胞膜保存完好。腹腔內(nèi)免疫Balb/

11、c小鼠，ELISA法檢測血清HpaA特異性IgG結(jié)果顯示，與大腸桿菌ghost和PBS組相比，兩種方案制備的重組大腸桿菌ghost可有效刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生針對HpaA抗原特異性IgG應答。 總之，本課題成功地制備了膜錨定表達HpaA的重組大腸桿菌ghost，初步建立了制備和鑒定該型疫苗的技術(shù)平臺，為今后研制有效的“Bacterialghost”型幽門螺桿菌疫苗奠定了相關基礎。但本研究中重組大腸桿菌ghost的制備尚存在HpaA蛋白