虎源H-,5-N-,1-亞型流感病毒HA基因與NP基因核酸疫苗和重組腺病毒活載體疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]構(gòu)建能夠分別表達(dá)虎源H5N1亞型流感病毒血凝素(HA)基因和核蛋白(NP)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒以及表達(dá)HA和NP蛋白重組犬2型腺病毒(CAV-2)活載體疫苗（CAV-2-HA和CAV-2-NP），用所構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒和活載體疫苗免疫小鼠，檢測(cè)各質(zhì)粒和活載體疫苗的免疫水平及其攻毒保護(hù)率，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)為哺乳動(dòng)物H5N1亞型流感病毒核酸疫苗和重組活載體疫苗的應(yīng)用研究提供理論與技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 [方法]利用設(shè)計(jì)合成的HA和NP引物

2、，從A/Tiger/Harbin/132/2007(H5N1)毒株的雞胚尿囊增殖液中對(duì)該毒株的HA和NP基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序分析；應(yīng)用常規(guī)分子生物學(xué)方法，構(gòu)建能夠分別表達(dá)H5N1亞型流感病毒HA和NP基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-HA和pVAX-NP以及同時(shí)表達(dá)貓IL-18基因和H5N1亞型流感病毒NP/HA基因的雙表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP，應(yīng)用間接免疫熒光和間接ELISA方法檢測(cè)各

3、真核表達(dá)質(zhì)粒在乳倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞(BHK-21)中的表達(dá)情況。
　　 然后將含有NP/HA基因的表達(dá)盒(CMV+NP/HA+PolyA)克隆入pVAXE3的SspⅠ酶切缺失處，分別獲得含有NP/HA表達(dá)盒的穿梭載體pVAX△E3-NP/HA。用SalⅠ+Nru1分別對(duì)pVAX△E3-NP/HA和pPoly2-CAV2進(jìn)行雙酶切，將含有NP/HA表達(dá)盒的片段定向克隆入pPoly2-CAV2，獲得在E3區(qū)缺失處插入NP/HA表達(dá)盒的重

4、組質(zhì)粒pCAV-2-NP/HA。釋放CAV-2-NP/HA重組基因組，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染犬腎細(xì)胞(DK)，獲得了能使DK細(xì)胞產(chǎn)生典型腺病毒樣細(xì)胞病變的重組病毒(CAV-2-NP/HA)。從形態(tài)學(xué)、基因組水平、NP/HA基因的轉(zhuǎn)錄、NP/HA蛋白的表達(dá)以及重組病毒的生長(zhǎng)特征等方面進(jìn)行鑒定。
　　 用所構(gòu)建的4種真核表達(dá)質(zhì)粒和2種重組病毒分別進(jìn)行小鼠免疫實(shí)驗(yàn)和攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)。真核表達(dá)質(zhì)粒的免疫實(shí)驗(yàn)共設(shè)pVAX-HA、pVAX-NP、pVA

5、X-HA和pVAX-NP聯(lián)合、pIRES2-IL-18-HA、pIRES2-IL-18-NP、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP聯(lián)合、PBS對(duì)照7個(gè)免疫組，每組11只小鼠，采用肌肉注射的方法，以15天的時(shí)間間隔免疫3次后15天，用間接ELISA方法檢測(cè)各免疫組小鼠產(chǎn)生的抗AIV的抗體水平；用MTT法檢測(cè)各免疫組小鼠產(chǎn)生的細(xì)胞免疫水平；用H5N1亞型流感病毒強(qiáng)毒株滴鼻攻毒，檢測(cè)各免疫組的攻毒保護(hù)率。
　　

6、 重組病毒的免疫實(shí)驗(yàn)共設(shè)CAV-2-HA、CAV-2-HA和CAV-2-NP聯(lián)合免疫、CAV-2三組，每組13只小鼠。采用滴鼻(50μL)+皮下注射(250μL)的免疫方法，以14天的時(shí)間間隔共免疫接種2次。每次免疫后14天，每組各撲殺2只采血收集血清，剩下9只中3只用于攻毒后4天處死，測(cè)定攻毒后肺滴度，剩余6只用于檢測(cè)攻毒后的保護(hù)率。[結(jié)果]成功克隆了A/Tiger/Harbin/132/2007(H5N1)毒株的HA和NP全基因，

7、長(zhǎng)度分別為1704bp和1479bp，分別編碼568和493個(gè)氨基酸。成功構(gòu)建了表達(dá)虎源H5N1亞型流感病毒HA和NP蛋白的4種真核表達(dá)質(zhì)粒(pVAX-HA、pVAX-NP、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP)和2種重組病毒(CAV-2-HA和CAV-2-NP)。
　　 這4種真核表達(dá)質(zhì)粒均能在BHK-21細(xì)胞中表達(dá)具有生物活性的HA和NP蛋白，均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫，各免疫組小鼠

8、在受到超大劑量（10000MLD50/只）的強(qiáng)毒攻擊后，各組免疫保護(hù)率分別為：pVAX-HA組60％、pVAX-NP組20％、pVAX-HA和pVAX-NP聯(lián)合組60％、pIRES2-IL-18-HA組20％、pIRES2-IL-18-NP組0％、pIRES2-IL-18-HA和pIRES2-IL-18-NP聯(lián)合組20％、PBS對(duì)照組0％。
　　 CAV-2-NP/HA具有典型的CAV-2形態(tài)特征，CAV-2-NP/HA在繁殖的

9、過(guò)程中沒(méi)有對(duì)H5N1NP/HA表達(dá)盒片段進(jìn)行缺失或重排，并且能夠轉(zhuǎn)錄H5N1NP/HA的mRNA，ELISA和免疫熒光分析表明重組表達(dá)產(chǎn)物可被流感病毒NP/HA單克隆抗體所識(shí)別，在體外具有良好的遺傳穩(wěn)定性。動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)表明CAV-2-HA、CAV-2-NP兩種重組活載體疫苗均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)，以CAV-2-HA效果最好，對(duì)小鼠的攻毒保護(hù)率為83.3％，CAV-2-HA和CAV-2-NP聯(lián)合免疫的保護(hù)率為16.7％，對(duì)照組(