甲型流感病毒不同亞型混合感染分析及N9亞型流感病毒NA基因進(jìn)化分析.pdf

1、流感病毒可引起急性呼吸道傳染病并且該病毒每年都有不同規(guī)模的小流行，若干年一次全球范圍的大流行，給人類(lèi)健康和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展帶來(lái)負(fù)面影響。作為流感病毒表面包膜主要的兩種糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)，不但與病毒的致病性有關(guān)，同時(shí)HA和NA還要承受著外界環(huán)境的選擇壓力，在這些選擇壓力之下往往會(huì)引起HA和NA的變異，也會(huì)增加產(chǎn)生新型病毒的可能性。本研究共分為兩個(gè)方面對(duì)流感病毒不同亞型

2、的共同感染及流感病毒的進(jìn)化進(jìn)行描述。希望借此為闡明流感病毒流行規(guī)律提供新的依據(jù)。
　　第一部分
　　目的：了解一例新甲型H1N1和季節(jié)性H3N2亞型流感混合感染病例中季節(jié)性H3N2亞型流感病毒和新甲型H1N1亞型流感病毒的HA和NA基因的變異情況。
　　方法：鼻咽拭子的核酸樣本和細(xì)胞培養(yǎng)物100倍稀釋的核酸樣本經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR方法鑒定流感病毒亞型。病毒經(jīng)MDCK細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）和紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(

3、HI)。分離病毒毒株，提取核酸經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法擴(kuò)增HA和NA基因，獲得測(cè)序結(jié)果與WHO推薦的疫苗株和疫苗相似毒株同源比對(duì)，使用生物信息軟件繪制種系發(fā)生樹(shù)。
　　結(jié)果：鼻咽拭子和細(xì)胞培養(yǎng)物實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)為季節(jié)性H3N2陽(yáng)性（CT值25.837 VS15.675）；新甲型H1N1陽(yáng)性(CT值20.267 VS25.169)。季節(jié)性H3N2 HI滴度為>1280，新甲型H1N1 HI滴度為80。通過(guò)與2013

4、至2014年WHO推薦的疫苗株比對(duì)結(jié)果分離毒株的HA與 A/Victoria/361/2011(H3N2)和A/Texas/50/2012(H3N2)的HA片段比較,氨基酸殘基其同源性分別為96.7％和97.1%。與 A/Texas/50/2012(H3N2)的NA片段同源性為99.6%。分離的新甲型H1N1亞型流感病毒毒株中HA與NA氨基酸殘基與疫苗株A/California/07/2009(H1N1)比對(duì)， HA與 NA片段的同源性

5、分別為97.9%和97.8%。同時(shí)比對(duì)中發(fā)現(xiàn)無(wú)論季節(jié)性H3N2亞型還是新甲型H1N1流感病毒分離毒株HA和NA蛋白都出現(xiàn)了一些氨基酸位點(diǎn)的變異，而且一些位點(diǎn)涉及抗原決定區(qū)域。在NA序列比對(duì)中未發(fā)現(xiàn)如奧司他韋和扎那米韋等神經(jīng)氨酸酶抑制類(lèi)藥物的耐藥位點(diǎn)變異。
　　結(jié)論：通過(guò)本研究說(shuō)明在兩種亞型共同流行期間，采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法可檢測(cè)人季節(jié)性H3N2和新甲型H1N1混合感染病例。并希望通過(guò)本次研究為流感的進(jìn)一步預(yù)防和相關(guān)疫苗發(fā)展提供更

6、多信息。
　　第二部分
　　目的：通過(guò)對(duì)甲型N9亞型流感病毒神經(jīng)氨酸酶（NA）核苷酸進(jìn)化趨勢(shì)的研究，進(jìn)而探尋新型H7N9亞型禽流感病毒產(chǎn)生的根源。
　　方法：本次研究選取美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的甲型N9亞型流感病毒的NA序列，采用生物軟件ClustalX2.0和MEGA6.0建立進(jìn)化樹(shù)形圖。對(duì)其歐亞分支，采用BEAST軟件2.1.2和Datamonkey interface在線(xiàn)軟件，計(jì)算和分析選擇壓力和進(jìn)

7、化速率。采用Bioedit軟件對(duì)NA的氨基酸置換熵值計(jì)算并分析。
　　結(jié)果：系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明2013年新型H7N9亞型禽流感病毒可劃分至現(xiàn)代歐亞分支之內(nèi)，并且該分支的每位點(diǎn)每年核苷酸置換速率均值為3.8354×10-3，選擇壓力dN/dS均值為0.140413。16、19、40、53、81、84、112、256、335、359、401的氨基酸變異位點(diǎn)熵值>0.5。
　　結(jié)論：研究分析表明2013年新型H7N9亞型禽流感病毒的N