牛氣腫疽CctA基因核酸疫苗的制備及免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、氣腫疽（Clostridium chauvoei）是一種由專性厭氧菌氣腫疽梭菌引起的牛、羊等急性、敗血性傳染病。常見的病理特征分別為肌群部位有炎性癥狀、氣性腫脹，觸壓時(shí)產(chǎn)生捻發(fā)音，并且具有地區(qū)流行性、季節(jié)性等特點(diǎn)。此病夏季多發(fā)，多見于潮濕的山谷牧場(chǎng)和沼澤地區(qū)。延邊朝鮮族自治州位于吉林省東側(cè)，山區(qū)叢林茂密多雨，近些年牛氣腫疽的發(fā)病率相對(duì)較高，給當(dāng)?shù)氐男竽翗I(yè)和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展影響巨大，并且對(duì)當(dāng)?shù)鼐用竦恼Ｉ钜伯a(chǎn)生了極大的威脅。
　　為了控

2、制延邊地區(qū)氣腫疽病的發(fā)病率，制備安全且有效的氣腫疽核酸疫苗是非常必要的，本試驗(yàn)的建立基礎(chǔ)是根據(jù)NCBI上氣腫疽梭菌細(xì)胞毒素A(CctA)的基因序列設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物。將PCR擴(kuò)增的CctA基因通過PCR擴(kuò)增后克隆到pMD19-T simple載體，分析通過正確測(cè)序的CctA基因序列，再次克隆至pcDNA3.1-1真核表達(dá)載體，并且將其轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞，用來確定CctA基因是否表達(dá)的方法分別為間接免疫熒光和免疫印跡兩種方法。測(cè)定表達(dá)質(zhì)

3、粒濃度后進(jìn)行小鼠免疫試驗(yàn)，使用間接ELISA測(cè)定小鼠IgG1、IgG2a抗體水平，用ELISA試劑盒測(cè)定IL-4和IFN-γ細(xì)胞因子水平。
　　研究結(jié)果顯示，CctA基因通過擴(kuò)增后為519 bp，同源性比對(duì)氣腫疽梭菌ATCC10092菌株和測(cè)序后得到的CctA基因核苷酸和氨基酸序列，存在3處點(diǎn)突變，與其他6株菌氨基酸序列比較存在2個(gè)位點(diǎn)突變;這些氨基酸序列的同源性為98.8％，核苷酸序列的同源性為99.4％。pcDNA3.1-Cc

4、tA組通過轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞存在綠色熒光的現(xiàn)象，同時(shí)pcDNA3.1-CctA重組質(zhì)粒表達(dá)的產(chǎn)物大小約是19kD，說明Vero細(xì)胞中的pcDNA3.1-CctA質(zhì)粒成功表達(dá)了CctA蛋白。BALB/c小鼠免疫學(xué)試驗(yàn)表明，三免后，pcDNA3.1-cctA組和蛋白組的IgG1和IgG2a極顯著高于PBS組和pcDNA3.1組(P＜0.01)，PBS組和pcDNA3.1組的IgG1和IgG2a水平無顯著性差異(P＞0.05);蛋白組細(xì)胞因子IFN