沙門氏菌invH基因亞單位疫苗和C3d分子佐劑核酸疫苗的制備與免疫效果研究.pdf

1、沙門氏菌是重要的腸道病原菌，根據(jù)抗原的不同分為2500個(gè)血清型，絕大多數(shù)沙門氏菌對(duì)人和動(dòng)物都有致病性，并是人類食物中毒的主要病源之一，嚴(yán)重影響著人和動(dòng)物的健康。因而，通過探討沙門氏菌invH基因的免疫功能，對(duì)研制新型疫苗防治沙門氏菌病具有重要意義。本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)，首先將沙門氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的invH入侵基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，然后制備了重組蛋白疫苗和C3d分子佐劑核酸疫苗，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染和動(dòng)物試驗(yàn)，探索了invH的免疫功能，取得了預(yù)

2、期的效果。本研究分三部分內(nèi)容：
　　 ⑴不同來源沙門氏菌入侵基因invH的檢測及序列分析。根據(jù)沙門氏菌invH基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)9株沙門氏菌和4株常見病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增出的invH基因進(jìn)行克隆及序列分析，應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測invH蛋白的T細(xì)胞抗原表位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9株沙門氏菌PCR均擴(kuò)增出519bp的特異條帶,4株非沙門氏菌均無特異帶擴(kuò)增；核苷酸序列分析證實(shí)，9株菌中3株鼠傷寒沙門氏菌之間同

3、源性為99.8％，與雞白痢和雞腸炎沙門氏菌之間的核苷酸序列同源性為98.6％；3株豬傷寒沙門氏菌和3株雞源性沙門氏菌同源性低，且不在同一條系統(tǒng)進(jìn)化樹上；invH蛋白有5個(gè)重復(fù)率最高的T淋巴細(xì)胞受體識(shí)別的抗原表位。該研究建立的沙門氏菌的PCR檢測方法具有很好的特異性和敏感性，不同來源沙門氏菌的invH基因有種屬差異性，基因表達(dá)蛋白的氨基酸序列決定了其具有刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的分子基礎(chǔ)。
　　 ⑵沙門氏菌invH

4、基因的重組表達(dá)與免疫功能研究。采用PCR技術(shù)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌（DT104株）的入侵基因H進(jìn)行擴(kuò)增，將其克隆到原核表達(dá)載體PGEX-4T-3中，將重組克隆進(jìn)行融合蛋白表達(dá)、純化和Western blot檢測，用油乳劑佐劑將融合蛋白制備蛋白疫苗，將該疫苗通過三種不同劑量（40μg/只、60μg/只、80μg/只）免疫注射小鼠進(jìn)行免疫保護(hù)效果測定，采用黏附與黏附抑制試驗(yàn)對(duì)抗血清的活性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，構(gòu)建的重組克隆成功表達(dá)了44KD的融合蛋

5、白GST-invH，且該蛋白具有良好的免疫原性；三種劑量蛋白疫苗間的免疫效果差異不顯著，均能提高小鼠體內(nèi)IL-4和IFN-γ的含量，與對(duì)照組比較差異顯著（p<0.05）；滅活疫苗組保護(hù)率為90％，三種劑量重組蛋白疫苗組的保護(hù)率均在60％以上，雖然重組蛋白疫苗的保護(hù)效果不及滅活疫苗，但與對(duì)照組相比差異均極顯著（p<0.01）；體外黏附抑制試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗融合蛋白GST-invH的抗體能抑制沙門氏菌對(duì)靶細(xì)胞的黏附。該研究結(jié)果為沙門氏菌病的有

6、效防制提供了科學(xué)依據(jù)。
　　 ⑶C3d-P28分子佐劑沙門氏菌invH核酸疫苗的構(gòu)建及免疫效果研究。分別克隆小鼠的C3d-P28基因和沙門氏菌的invH基因，構(gòu)建pcDNA3.1-invH和pcDNA3.1-invH-P28.6（含invH基因和6個(gè)拷貝的C3d-P28編碼的基因）重組質(zhì)粒；提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞、IFA檢測蛋白表達(dá)，將小鼠隨機(jī)分成5組，空白對(duì)照組（I）、滅活疫苗組（II）、空質(zhì)粒組（III）、pc

7、DNA3.1-invH組（IV）和pcDNA3.1-invH-P28.6（V），核酸疫苗組采用肌肉注射，100μg/100μL·只，注射3次，每次間隔2周。用ELISA試劑盒檢測小鼠體內(nèi)抗體水平和IL-4、IFN-γ含量。第7周，用鼠傷寒沙門氏菌DT104株攻毒，100LD50/只，計(jì)算保護(hù)率、抗血清體外活性分析。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了沙門氏菌的核酸疫苗（pcDNA3.1-invH、pcDNA3.1-invH-P28.6），并能在Marc