分子佐劑C3d3增強(qiáng)hCGβDNA和粘膜疫苗體液免疫效應(yīng)的機(jī)制.pdf

1、研究背景 基于hCGβ的避孕疫苗，是目前唯一完成II期臨床試驗的避孕疫苗。但尚面臨許多困難，必須尋找更理想的載體、分子佐劑，合適的免疫途徑，以增強(qiáng)它的免疫原性，提高其避孕效果。C3d分子通過與B細(xì)胞表面CD21分子的直接結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用，因此C3d作為分子佐劑，為解決人群中的個體差異創(chuàng)造機(jī)遇，并恰好符合避孕疫苗追求體液免疫效應(yīng)的目標(biāo)。本實驗室在以往的研究中，將C3d3與hCGβ基因融合，成功構(gòu)建了hCGβ DNA疫苗pCMV

2、4-hCGβ-C3d3、hCGp粘膜疫苗Lb．hCGβ-C3d3。并且證明分子佐劑C3d3可明顯增強(qiáng)避孕疫苗的體液免疫效應(yīng)及抗生育作用。但這兩種疫苗作用的分子機(jī)制尚不明了，分子佐劑C3d3的作用機(jī)制尚不清楚。 目的 本研究用hCGβDNA疫苗和hCGβ粘膜疫苗分別經(jīng)小鼠肌肉注射免疫和陰道粘膜接種，觀察這兩種疫苗在小鼠全身和生殖道局部的抗hCGD體液免疫效應(yīng)，觀察分子佐劑C3d3對免疫反應(yīng)的作用；分析ASC表面和組織局部的

3、趨化因子/受體和粘附分子配體/受體，探討ASC游走以及ASC歸巢至生殖道的分子機(jī)制，以解析hCGβDNA疫苗和粘膜疫苗的抗生育作用。分子佐劑C3d3通過上調(diào)B細(xì)胞CXCR4和CD62L的表達(dá)及促進(jìn)ASC游走而增強(qiáng)hCGβDNA疫苗體液免疫效應(yīng)。 方法 將hCG13DNA疫苗pCMV4-hCGβ-C3d3、pCMV4-hCGβ和pCMV4分別肌肉注射BALB/c小鼠。間接ELISA法測定抗hCGβ血清/陰道灌洗液抗體效價；

4、ELISPOT分析小鼠脾臟和子宮的抗體分泌細(xì)胞；RT-PCR分析小鼠脾臟B細(xì)胞17種趨化因子受體及脾臟組織中相關(guān)配體的轉(zhuǎn)錄；FCM分析CXCR4蛋白水平；ELISA檢測CXCL12的分泌；趨化試驗觀察CXCL12對外周血B細(xì)胞的趨化作用；遷移試驗觀察CXCL12趨化各免疫組脾臟局部B細(xì)胞，再ELISPOT檢測趨化f=來的ASC數(shù)目；FCM分析脾臟局部B細(xì)胞粘附分子CD62L/VLA/LFA的表達(dá)；免疫組化分析脾臟相關(guān)粘附分子受體MAdC

5、AM/VCAM/ICAM的表達(dá)。 結(jié)果 在DNA免疫中，pCMV4-hCGβ-C3d3產(chǎn)生抗hCGp IgG血清抗體明顯高于pCMV4-hCGβ；抗hCGβ IgA血清抗體兩組無明顯差異；pCMV4-hCGβ-C3d3產(chǎn)生的陰道灌洗液抗hCGβ IgG/IgA抗體水平較低，與pCMV4-hCGβ比較無明顯差異；pCMV4-hCGβ-C3d3脾臟抗hCGβ IgG ASC明顯高于pCMV4-hCGβ，脾臟IgAASC與子宮

6、IgG/IgAASC兩組間無明顯差異。經(jīng)DNA免疫后，脾臟B細(xì)胞CXCR4在pCMV4-hCGβ-C3d3和pCMV4-hCGβ免疫后明顯升高，且pCMV4-hCGβ-C3d3明顯高于pCMV4-hCGl3；CXCR4的配體CXCL12在粘膜免疫后脾臟組織中亦明顯升高，但pCMV4-hCGβ-C3d3與pCMV4-hCGβ無明顯差異。因此，C3d3能顯著上調(diào)脾臟ASC表達(dá)CXCR4，但并不能明顯提高脾臟局部CXCL12的表達(dá)。趨化試驗提

7、示，pCMV4-hCGβ和pCMV4-hCGβ-C3d3脾臟組織上清均能明顯趨化外周血B細(xì)胞，但兩組間無明顯差異，抗SDF-1抗體可部分阻斷趨化作用。遷移試驗結(jié)果顯示，SDF-1能明顯趨化pCMV4-hCGβ-C3d3和pCMV4-hCGβ組脾臟局部的B細(xì)胞，且pCMV4-hCGβ-C3d3組趨化的B細(xì)胞明顯比pCMV4-hCGβ組多，加用抗CXCR4抗體后，SDF-1對免疫組脾臟B細(xì)胞的趨化作用與對照組無明顯差異，用被趨化的B細(xì)胞作E

8、LISPOT，pCMV4-hCGβ-C3d3組ASC明顯多于pCMV4-hCGβ組，說明C3d3升調(diào)節(jié)ASC表達(dá)CXCR4，增加ASC對CXCL12的反應(yīng)性，促進(jìn)ASC游走。FCM分析脾臟B細(xì)胞粘附分子發(fā)現(xiàn)，在各免疫組LFA和vLA表達(dá)較低，且各組間無明顯差異，而CD62L在各免疫組均有表達(dá)，pCMV4-hCGβ-C3d3和pCMV4-hCGβ組明顯高于對照組，且pCMV4-hCGβ-C3d3組顯著高于pCMV4-hCGβ組。免疫組化分

9、析脾臟相關(guān)粘附分子受體發(fā)現(xiàn)，MAdCAM/VCAM/ICAM在各免疫組均有表達(dá)，但各組間無明顯差異。 結(jié)論 hCGβDNA疫苗主要在全身產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。C3d3能增強(qiáng)系統(tǒng)性體液免疫效應(yīng)。DNA疫苗促進(jìn)ASC高表達(dá)CXCR4、CD62L，增加對CXCL12的反應(yīng)性，通過CD62L/MAdCAM的相互作用，有利于ASC游走。分子佐劑C3d3通過上調(diào)B細(xì)胞CCR9和VLA的表達(dá)及促進(jìn)ASC歸巢而增強(qiáng)hCGβ粘膜疫苗體液免疫效

10、應(yīng)方法將重組乳酸桿菌Lb．pllac、Lb．hCGβ、Lb．hCGβ-C3d3分別經(jīng)陰道接種BALB/c小鼠。間接ELISA法測定抗hCGβ血清/陰道灌洗液抗體效價；ELISPOT分析小鼠脾臟和子宮的抗體分泌細(xì)胞；RT-PCR分析子宮B細(xì)胞17種趨化因子受體及子宮組織中相關(guān)配體的轉(zhuǎn)錄；FCM分析CCR9蛋白水平；ELISA檢測CCL25的分泌：趨化試驗觀察CCL25對外周血B細(xì)胞的趨化作用；遷移試驗觀察CCL25趨化各免疫組子宮局部B細(xì)

11、胞，再ELISPOT檢測趨化下來的ASC數(shù)目：FCM分析子宮局部B細(xì)胞粘附分子CD62L/VLA/LFA的表達(dá)：免疫組化分析子宮相關(guān)粘附分子受體MAdCAM/VCAM/ICAM的表達(dá)。結(jié)果在粘膜免疫中，Lb．hCGβ-C3d3免疫組血清抗hCGβ IgG抗體水平明顯高于Lb．hCGβ組；血清抗hCGβ IgA抗體兩組無明顯差異；Lb．hCGβ-C3d3免疫組陰道灌洗液抗hCOβ IgG及IgA抗體比Lb．hCGβ明顯增高。Lb．hCGβ

12、-C3d3和Lb．hCGβ免疫組脾臟抗hCGβ IgG/IgA ASC無明顯差異；Lb．hCGβ-C3d3免疫組子宮抗hCGβ IgG及IgAASC均明顯高于Lb．hCGβ組。經(jīng)粘膜免疫后，子宮局部B細(xì)胞CCR9在Lb．hCGβ和Lb．hCGβ．C3d3免疫后明顯升高，且Lb．hCGβ-C3d3明顯高于Lb．hCGβ；CCR9的配體CCL25在粘膜免疫后子宮組織中明顯升高，但Lb．hCGβ-C3d3與Lb．hCGβ無明顯差異。說明C3d

13、3能顯著上調(diào)子宮局部B細(xì)胞表達(dá)CCR9，但不能明顯提高子宮局部CCL25的表達(dá)。趨化試驗顯示：Lb.hCGB和Lb.hCGβ-C3d3免疫組子宮組織上清均能明顯趨化外周血B細(xì)胞，但是兩組間無明顯差異，加用TECK抗體可部分阻斷趨化作用。遷移試驗結(jié)果顯示，TECK能明顯趨化Lb．hCGβ和Lb．hCGβ-C3d3組子宮局部的B細(xì)胞，且Lb．hCGβ-C3d3組趨化的B細(xì)胞明顯比Lb．hCGβ組多，用被趨化的B細(xì)胞作ELISPOT，Lb．h

14、CGβ-C3d3組ASC明顯多于Lb．hCGβ組。說明C3d3升調(diào)節(jié)ASC表達(dá)CCR9，通過CCR9/CCL25相互作用，增加ASC歸巢到生殖道局部。FCM分析子宮B細(xì)胞粘附分子發(fā)現(xiàn)，在各免疫組CD62L均有表達(dá)，但各組間無明顯差異；LFA在各免疫組也都有表達(dá)，但是表達(dá)較低，且各組間無明顯差異；VLA在各免疫組均有表達(dá)，Lb．hCGβ和Lb．hCGβ-C3d3組明顯高于對照組，且Lb．hCGβ-C3d3組B細(xì)胞VLA表達(dá)較Lb．hCGβ