傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）ORF092R的克隆、表達分析及細胞定位.pdf

1、傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)是造成養(yǎng)殖鱖暴發(fā)性死亡的主要病原，屬于虹彩病毒科腫大細胞病毒屬。ISKNV是腫大細胞病毒屬中首個全基因組序列被測定的病毒。 ISKNV基因組中ORF092R長276bp，編碼一個91個氨基酸，分子量為10369.02道爾頓的蛋白。生物信息學預測該蛋白是定位于線粒體的單次跨膜蛋白。為了研究其基因功能，根據ISKNV的基因組序列，設計和制作了基于寡聚核苷酸探針的基因芯片，并檢測了ISKNV感染鱖后不同

2、感染時間段脾臟中ORF092R的轉錄情況，再結合半定量RT-PCR結果，得到ORF092R在ISKNV增殖過程中不同時段的時相表達譜。 為了進一步研究ORF092R，通過基于RNA連接酶的cDNA末端快速擴增(RNAligasemediatedrapidamplificationofcDNAend，RLM-RACE)技術成功獲取了其5'端cDNA序列，確定了ORF092R的轉錄起始位點位于基因組的84394bp。通過PCR擴增O

3、RF092R后，克隆到真核表達載體pEGFP-N3上，重組質粒轉染FHM(fatheadminnow)細胞后通過激光共聚焦倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)病毒蛋白092(virusprotein092，VP092)與GFP(greenfluorescentprotein)的融合蛋白在線粒體膜附近的區(qū)域有較多的聚集。Western免疫印跡檢測也確定了VP092主要存在于細胞的線粒體粗提組分中?；谀さ鞍椎奶攸c，選用pET載體高效表達了兩次重復的VP09