鱖傳染性脾腎壞死病毒滅活疫苗檢驗(yàn)關(guān)鍵技術(shù)研究.pdf

1、由鱖傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)引起的鱖虹彩病毒病是危害鱖養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)最主要疫病，而疫苗接種是預(yù)防該病最為有效的技術(shù)手段。在疫苗制備過程中，安全性和效力是評(píng)價(jià)疫苗質(zhì)量重要指標(biāo)，而滅活快速檢驗(yàn)及抗原含量測定是評(píng)價(jià)滅活疫苗安全性和效力的關(guān)鍵技術(shù)，因此本論文針對(duì)ISKNV滅活疫苗制備中關(guān)鍵問題，開展了ISKNV滅活快速檢驗(yàn)及有效抗原含量測定方法研究及應(yīng)用，旨在提高ISKNV滅活疫苗生產(chǎn)效率和疫苗質(zhì)量，取得的主要結(jié)果如下:
　　1、從IS

2、KNV感染CPB細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜中篩選并驗(yàn)證病毒早期基因ORF099基因表達(dá)量最高，以該基因轉(zhuǎn)錄本作為靶標(biāo)，建立了基于熒光定量RT-PCR監(jiān)測病毒mRNA的滅活快速檢測方法。首先，以含ISKNV ORF099基因質(zhì)粒作為模板，采用qPCR方法繪制了CT值與質(zhì)粒拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程為CT=-3.421gx+39.455(R2=0.998)，最低檢測限為3拷貝/μL，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示組間和組內(nèi)變異系數(shù)均小于2％。病毒轉(zhuǎn)錄本靈敏度實(shí)驗(yàn)顯示在

3、第7d即可從接種1個(gè)拷貝病毒的細(xì)胞中檢測出ISKNV ORF099轉(zhuǎn)錄本。采用該方法對(duì)0.1％甲醛滅活72 h后的ISKNV樣品接種CPB細(xì)胞可檢測到ISKNV ORF099基因轉(zhuǎn)錄本，而0.1％終濃度甲醛滅活I(lǐng)SKNV在CPB細(xì)胞盲傳三代未出現(xiàn)CPE，魚體安全試驗(yàn)顯示接種魚體后無臨床發(fā)病癥狀和試驗(yàn)魚死亡，表明該方法靈敏度高于細(xì)胞盲傳法和魚體安全試驗(yàn)法。
　　2、通過將ISKNV感染CPB細(xì)胞后所獲得的病毒Unigene與病毒基因

4、組比對(duì)篩選獲得可能存在內(nèi)含子的病毒基因，經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證確認(rèn)ORF003L含有80bp內(nèi)含子，該內(nèi)含子命名為IN-3?？鏘N-3內(nèi)含子設(shè)計(jì)巢氏PCR引物擴(kuò)增ISKNV感染CPB細(xì)胞后cDNA，建立了基于跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物檢測病毒mRNA的滅活快速巢氏PCR檢測方法。結(jié)果顯示在第7d可從接種1個(gè)拷貝病毒的細(xì)胞cDNA樣品中檢測出209bp和289 bp兩條帶，說明該方法可排除樣品中病毒DNA殘留影響。采用該方法對(duì)0.1％甲醛滅活樣品接種C

5、PB細(xì)胞可檢測到ORF003L基因轉(zhuǎn)錄本，而細(xì)胞盲傳實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)CPE，魚體安全試驗(yàn)中無臨床發(fā)病癥狀和試驗(yàn)魚死亡，表明該方法靈敏度高于細(xì)胞盲傳法和魚體安全試驗(yàn)法。
　　3、用蔗糖密度梯度離心純化ISKNV病毒粒子，采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備特異性單克隆抗體。利用ISKNV重組MCP蛋白篩選獲得2株特異性的單克隆抗體株，分別命名為1C81B9和3B126B3，制備這2株單抗腹水，其效價(jià)為1∶106～1∶103，收集后的腹水選用Prote

6、in G-瓊脂糖親和層析柱進(jìn)行純化。以單克隆抗體株1C81B9作為包被單抗，生物素標(biāo)記的單克隆抗體株3B126B3作為檢測抗體，建立了ISKNV有效抗原含量測定的雙抗體夾心ELISA檢測方法。該方法檢測線性范圍為:4.69～300ng/mL，最低檢測限為0.9 ng/mL的抗原。用建立的方法檢測3個(gè)批次的ISKNV滅活疫苗有效抗原含量，結(jié)果與滅活前病毒滴度呈正相關(guān)。
　　4、采用建立的滅活快速檢驗(yàn)方法和有效抗原含量測定方法優(yōu)化了I

7、SKNV滅活條件，制定了抗原的保存期。采用二乙烯亞胺(BEI)、甲醛和β-丙內(nèi)酯(BPL)3種化學(xué)滅活劑在不同條件下對(duì)ISKNV進(jìn)行滅活，結(jié)果表明0.2％甲醛和4％ BEI在30℃滅活72h、0.1％ BPL在4℃滅活6h即可徹底滅活I(lǐng)SKNV;有效抗原含量測定結(jié)果表明BPL制備的病毒有效抗原含量均高于另外兩種滅活劑，滅活條件為采用0.1％ BPL在4℃滅活6h。將制備的病毒抗原液分別置于4℃和-80℃條件下保存1、3、6、12個(gè)月后檢