傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）ORF24和ORF50囊膜蛋白鑒定及基因工程候選疫苗的研制.pdf

1、傳染性脾腎壞死病毒(infectiousspleenandkidneynecrosisvirus，ISKNV)屬于虹彩病毒科，腫大細(xì)胞病毒屬。是可以導(dǎo)致鱖魚、美國紅魚等名貴水產(chǎn)魚類大批死亡的重要病源之一，近年來造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了研制其基因工程疫苗，控制該病毒的流行，通過生物信息學(xué)軟件分析，在ISKNV基因組中篩選了2個可能編碼囊膜蛋白的開放讀碼框(OpenReadingFrame，ORF)ORF24和ORF50。 根據(jù)G

2、enBank上ORF24和ORF50的核苷酸序列，分別設(shè)計了一對特異性引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增了兩個基因。將這兩個基因連接到原核表達(dá)載體pET32a(novagen)，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET32a-24和pET32a-50，再將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21進(jìn)行融合表達(dá)，融合蛋白VP24分子量約為50.6KD，VP50約為31.1kD，經(jīng)SDS-PAGE分析和Western-blot鑒定，證實了BL21正確表達(dá)了目的蛋白。表

3、達(dá)的融合蛋白主要以不可溶的包涵體形式存在，提取的包涵體中融合蛋白含量占50％以上，經(jīng)柱層析純化蛋白，純化度達(dá)90％以上。 以SDS-PAGE純化的兩種融合蛋白作抗原，分別免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。ELISA檢測兩種抗血清效價達(dá)1:11000。Western-blot檢驗，兩種抗血清中的IgG都能與目的蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。 從病魚組織中提取ISKNV病毒粒子。利用葡萄球菌pansorbine能吸附抗血清中的IgG，輔助抗

4、原抗體特異性結(jié)合的特性，檢測兩種多克隆抗體是否能與病毒囊膜特異性結(jié)合，從而證明相應(yīng)基因的功能。結(jié)果ORF50編碼囊膜蛋白。 將重組菌BL21/pET32a-24和pET32a-50表達(dá)的融合蛋白制備成疫苗，給鱖魚注射進(jìn)行主動免疫。陰性對照組注射PBS不攻毒，陽性對照組不免疫(以下同)。兩種蛋白的為混合疫苗免疫鱖魚效果最好，最后疫苗組相對存活率(relativepercentagesurvival，RPS)有75％。同時，陰性對照

5、組無死亡，而陽性對照組全部死亡(以下同)。 被動免疫，先注射多克隆抗血清24小時后再注射病毒液，RPS60％；先注射病毒液24小時后再多克隆抗血清，RPS20％。中和實驗，將兩種兔抗融合蛋白血清與病毒液1:1:1比例混合，常溫孵育10-15分鐘后，注射鱖魚，RPS為80％。 對廣東南海2000尾池養(yǎng)鱖魚進(jìn)行ISKNV基因工程疫苗中試，免疫方法和主動免疫相同。隨即抽取20尾攻毒，RPS有70％。免疫實驗表明所制備的疫苗對I