四川地區(qū)1株虹鱒(Oncorhynchus mykiss)源傳染性造血器官壞死病毒的分離鑒定.pdf

1、2013年，四川成都彭州某冷水魚養(yǎng)殖場虹鱒暴發(fā)一種流行性傳染病，具有發(fā)病率和死亡率高的特點（幼魚和魚苗死亡率分別高達(dá)40％和80％）。對送檢樣品進(jìn)行剖解和組織病理學(xué)觀察。典型表觀臨床癥狀表現(xiàn)為體色發(fā)黑，腹部膨大，體表多處出現(xiàn)瘀點，病程長的病魚肛門到尾鰭基部大面積出血，吻部潰爛、出血，部分病魚眼眶充血，肛門處流出淡黃色粘液便。剖解后可見膘膜、腹膜、心包膜、腦膜、脂肪組織嚴(yán)重點狀出血，肝臟發(fā)白，脾臟發(fā)黑腫大，腎臟腫大、淤血，部分病魚可見心臟

2、出血點，胃脹氣膨大，腸道呈明顯的出血性-卡他性炎，腸壁變薄，剖開胃和腸道可見透明淡黃色粘液。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)頭腎、腎、腸道、脾和肝臟等器官的損傷非常顯著。典型病理變化表現(xiàn)為頭腎實質(zhì)大面積變性、壞死;腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，間質(zhì)造血組織壞死;腸道腸粘膜上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，粘膜下層聚集大量壞死的嗜酸性顆粒細(xì)胞;脾廣泛變性、壞死，巨噬細(xì)胞侵潤，肝細(xì)胞變性，壞死形成局灶性的壞死灶，并在肝細(xì)胞胞漿發(fā)現(xiàn)包涵體。其臨床癥狀和典型的病理

3、組織損傷與傳染性造血器官壞死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）感染類似。
　　參照Williams等的方法合成三對檢測虹鱒病毒性疾病的引物，針對IHNV、傳染性胰腺壞死（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）與出血性敗血癥病毒(viralhemorrhagic septicemia virus，VHSV)的多重RT-PCR檢

4、測顯示自然發(fā)病魚為IHNV陽性，測序后的擴增產(chǎn)物與GenBank中進(jìn)行Blast比對，擴增序列與IHNV核蛋白(Nucleoprotein，N)基因同源性為99.9％。取病魚的肝、脾組織研磨過濾菌后接種到鯉魚上皮瘤細(xì)胞（epithelioma papulossum of carp，EPC），盲傳3代出現(xiàn)典型的壞死，脫落，形成空斑等細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）。并將病變細(xì)胞懸液腹腔注射20尾健康虹鱒，注射組均

5、表現(xiàn)為急性死亡（累計死亡率=75％），試驗魚出現(xiàn)與自然發(fā)病魚相同的癥狀而對照組無異常。提取病變細(xì)胞和人工感染病毒的RNA進(jìn)行多重RT-PCR鑒定，結(jié)果顯示位于約371bp處均可見特異性DNA擴增條帶，與IHNV預(yù)期大小一致。本節(jié)利用鯉魚上皮瘤細(xì)胞從患病虹鱒分離了一株傳染性造血器官壞死病毒，命名為LQN131107，經(jīng)人工感染試驗和多重RT-PCR鑒定進(jìn)一步確定該病的病原是IHNV。
　　參考GenBank中IHNV核蛋白基因開放閱

6、讀框（open reading frame，ORF）的序列（登錄號:KJ441078）設(shè)計引物，RT-PCR擴增獲得IHNV-LQN131107株核蛋白全長基因，純化后克隆至pMD19-T載體中進(jìn)行序列測定。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:IHNV-LQN131107株核蛋白基因的序列長度為1176 bp，編碼391個氨基酸殘基，富含亮氨酸(11.80％)、丙氨酸(10.50％)、谷氨酸(9.50％)、甘氨酸(9.20％);包含1個保守結(jié)構(gòu)域，

7、為Rhabdo_ncap_2;核蛋白不含有信號肽，不存在跨膜區(qū)，親水性大于疏水性;抗原表位預(yù)測結(jié)果顯示其抗原性良好;修飾位點預(yù)測顯示，存在1個潛在的N-糖基化位點、3個潛在的O-糖基化位點和18個潛在的磷酸化位點。參照Kolodziejek等的方法合成一對擴增部分糖蛋白基因的引物，RT-PCR擴增獲得糖蛋白基因，純化后克隆至pMD19-T載體中進(jìn)行序列測定。通過軟件構(gòu)建糖蛋白“Mid-G”基因區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，LQN131107株與