傳染性造血器官壞死病(IHN)核酸疫苗的構(gòu)建及其安全性的初步探究.pdf

1、傳染性造血器官壞死病病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）隸屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）諾拉彈狀病毒屬（Novirhabdovirus），是傳染性造血器官壞死病（Infectious hematopoietic necrosis，IHN）的病原體。IHN是鮭鱒魚(yú)類的最主要病毒性疾病之一。IHN的爆發(fā)會(huì)導(dǎo)致鮭鱒魚(yú)苗高達(dá)100％的死亡率，對(duì)世界鮭鱒魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大

2、的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了鮭鱒魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。自1953年IHN在北美引起人們關(guān)注以來(lái)，陸續(xù)在日本、歐洲和韓國(guó)也檢測(cè)到了IHNV，1988年傳入到中國(guó)。目前沒(méi)有治療IHN的有效藥物，國(guó)外商品化的IHN核酸疫苗由于存在毒株變異及生物安全因素?zé)o法直接引進(jìn)及應(yīng)用。本研究利用我國(guó)IHNV分離株，構(gòu)建了針對(duì)我國(guó)現(xiàn)行IHN的核酸疫苗，并在此基礎(chǔ)上初步開(kāi)展了核酸疫苗在虹鱒接種部位的動(dòng)態(tài)分布研究及疫苗載體青霉素抗性基因?qū)Νh(huán)境微生物的影響。
　　本

3、研究將我國(guó)IHNV分離株SD-12糖蛋白（Glycoprotein，G）基因克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)構(gòu)建了IHN核酸疫苗（命名為pIHNsd-G）。采用背鰭基部肌肉注射的方式，以2μg/尾的劑量免疫虹鱒（Oncorhynchus mykiss）魚(yú)苗（5±0.5 g）。在免疫后第4、30、60及150天，以IHNV分離株SD-12100倍半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（Tissue culture infective dose，TC

4、ID50）采取腹腔注射的方式進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，計(jì)算核酸疫苗相對(duì)保護(hù)率（Relative percent survival，RPS）；于免疫后第4天及第7天，利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)免疫虹鱒頭腎及接種部位肌肉組織Mx-1基因表達(dá)情況；在免疫后第4天、第30天、第60天及150天檢測(cè)免疫虹鱒血清IHNV中和抗體效價(jià)；在免疫后65天內(nèi)，分別于不同時(shí)間點(diǎn)采集循環(huán)水池里的糞便、水以及虹鱒的腸內(nèi)容物進(jìn)行氨芐青霉素抗性菌的分離鑒定；分別于免

5、疫后不同時(shí)間點(diǎn)，以核酸疫苗載體的啟動(dòng)子基因序列和氨芐青霉素抗性基因序列為目標(biāo)基因，利用PCR方法監(jiān)測(cè)核酸疫苗在免疫虹鱒接種部位的動(dòng)態(tài)分布情況。
　　攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示在免疫后第4天和第30天的核酸疫苗相對(duì)保護(hù)率分別為93.4%和91.4%，在免疫后第60天和150天pIHNsd-G對(duì)虹鱒的保護(hù)率都能達(dá)到89%以上。該結(jié)果說(shuō)明核酸疫苗pIHNsd-G對(duì)虹鱒具有良好的保護(hù)效果，能夠抵抗IHNV對(duì)虹鱒的進(jìn)攻。對(duì)免疫后第4天和第7天的頭腎及

6、接種部位肌肉組織RNA中Mx-1基因的定量分析結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，Mx-1基因在兩種組織中均顯著上調(diào)表達(dá)（P＜0.01），這一結(jié)果為IHN核酸疫苗的早期非特異性免疫保護(hù)提供了合理的解釋。中和抗體的效價(jià)結(jié)果顯示：在免疫后第4天，所有血清中均不存在中和抗體（效價(jià)均<20）；在免疫后第30天，只有兩尾魚(yú)的血清中不存在中和抗體，而剩余的8尾魚(yú)血清中均存有效價(jià)不同的中和抗體，其中最高效價(jià)高達(dá)160；在免疫后第60天，所有免疫虹鱒血清中均存

7、在中和抗體，其最高效價(jià)高達(dá)320；在免疫后第150天，有一尾魚(yú)的血清中不存在中和抗體（效價(jià)<20），而剩余的9尾魚(yú)血清中均存在不同效價(jià)的中和抗體，其中一尾魚(yú)效價(jià)最高（80）。該結(jié)果說(shuō)明pIHNsd-G能夠刺激虹鱒特異性免疫反應(yīng)，而使免疫虹鱒產(chǎn)生中和IHNV的抗體，因而能夠阻擋IHNV的進(jìn)攻?？剐跃蛛x結(jié)果顯示：分離到的氨芐青霉素抗性菌均是天然具有氨芐青霉素抗性的氣單胞菌（Aeromonas sp）和檸檬酸桿菌（Citrobacter s

8、p），并未分離到包括大腸桿菌在內(nèi)的任何具有抗性的指示菌，且實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的氨芐青霉素抗性菌的種類和數(shù)量均沒(méi)有發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變，證明了該核酸疫苗的抗性基因?qū)琪V體內(nèi)和及體外微生物環(huán)境都是安全的。pIHNsd-G在虹鱒接種部位的PCR監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：在免疫后的第1天即可在注射部位的肌肉中檢測(cè)到全部pIHNsd-G目標(biāo)片段，在84天時(shí)已經(jīng)無(wú)法從注射部位肌肉中擴(kuò)增出全長(zhǎng)氨芐青霉素抗性基因，而所有目標(biāo)基因在150天時(shí)均消失不見(jiàn)。本研究不但提供了