豬輪狀病毒四川株的分離與鑒定.pdf

1、豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)是全球養(yǎng)豬業(yè)引起仔豬腹瀉的主要病原之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失。我國斷奶仔豬PoRV感染也較普遍，因此開展該病的病原分離等防控技術研究具有重要意義。本研究對2012年四川成都某豬場的疑似PoRV感染的腹瀉病料進行RT-PCR檢測，再進行了病原分離，成功分離獲得一株輪狀病毒，并對該病毒的病毒特性進行了研究。
　　1.病毒的分離鑒定與特性
　　將RT-PCR檢測陽性的

2、腹瀉病料處理后接種到MA104細胞中，接毒中采用胰蛋白酶處理活化病毒的方法，60ug/ml胰酶敏化病毒液，并在維持液中使胰酶終濃度為6ug/ml。接毒后第一代便開始出現(xiàn)CPE，但不典型，到第三代時接毒第2天便開始出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，出現(xiàn)死細胞，并且死細胞堆積到一塊;第3天出現(xiàn)明顯的病變特征，表現(xiàn)為細胞界限不清、圓縮、堆積呈菜花狀，細胞開始脫落形成空泡區(qū)，直至第4天，大量的細胞死亡并脫落。將細胞分離病毒液連續(xù)傳至22代，每隔3代進行PCR鑒定

3、，結(jié)果擴增出預期大小的條帶，表明分離出的病毒為PoRV，將其命名為SC-C。測定其TCID50表明病毒以10-7.57倍稀釋后50ul接種細胞后可導致半數(shù)細胞死亡。理化性質(zhì)鑒定表明，該分離毒株對乙醚和氯仿均不敏感，但將其置56℃水浴30min可將其滅活，證明其不耐熱。
　　2.VP7基因的克隆、測序與分析
　　本研究根據(jù)GenBank中豬輪狀病毒VP7全基因序列，設計一對特異引物，對分離株的VP7進行了全基因克隆測序與序列分

4、析。結(jié)果表明VP7基因全長1061bp，編碼326個氨基酸，核苷酸序列與推導的氨基酸序列長度與其它PoRV的VP7基因相同。將VP7序列同52株韓國分離的豬輪狀病毒毒株比較，核苷酸序列和氨基酸序列同源性都在99％以上，表明PoRV的VP7序列相對較保守。將其同其它9株G5血清型毒株進行比對，核苷酸序列同源性為87.4％～99.8％，氨基酸序列同源性也高達92.6％～99.7％，而同其他血清型的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均較低，由此可推

5、斷出，該分離株屬于G5血清型。利用生物信息學軟件VP7蛋白進行分析，其相對分子量為37.018KD，等電點為4.86，不穩(wěn)定性系數(shù)為35.81，具有較強的穩(wěn)定性，脂溶指數(shù)為95.06，總平均親水性為0.072。該蛋白最大疏水指數(shù)為3.678，最小疏水指數(shù)為-2.400。預測VP7蛋白含有9個抗原位點，4-23位和32-54位存在2個跨膜區(qū)，推測此結(jié)構與VP7蛋白作為輪狀病毒的主要中和抗原相關。PredicProtein預測該VP7蛋白二

6、級結(jié)構中α-螺旋占30.67％，β-折疊占32.52％，β-轉(zhuǎn)角占36.81％，其功能位點中包含1個N-糖基化位點，4個蛋白激酶C磷酸化作用位點，3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位點，1個酪氨酸激酶磷酸化作用位點和3個N-豆蔻?；稽c。系統(tǒng)進化分析表明VP7基因同國內(nèi)東北分離到的一株A組豬輪狀病毒(JL94)親緣性最近，其次與牛源A組輪狀病毒具有較近進化距離。
　　3.病毒回歸試驗
　　取3.75×106PFU/m(l)細胞分離P

7、oRV病毒液感染4日齡乳豬進行動物回歸試驗，人工感染乳豬表現(xiàn)為感染3h后四處走動、步態(tài)不穩(wěn)、拱背腹痛癥狀、呼吸急促，頻率為70次/min，到第5天出現(xiàn)腹瀉癥狀，呈黃色水樣腹瀉。剖檢可見各腸段脹氣明顯，十二指腸腸壁變薄，空腸明顯充血，可見明顯的出血點。腸系膜出現(xiàn)嚴重充血且腸系膜淋巴結(jié)腫大。取十二指腸，空腸，回腸，結(jié)腸段進行RT-PCR檢測，均可見預期大小的條帶片段，由此可知各腸段均有PoRV感染。取感染豬腸及內(nèi)容物接種于MA104細胞，可

8、在第四天觀察到輕微的細胞病變，血清中和實驗表明1∶23.47倍稀釋的標準PoRV陽性血清能中和該病毒的致細胞病變作用。間接ELISA檢測感染后血清IgG可知乳豬口服病毒后產(chǎn)生較高滴度的IgG抗體水平，口服滅活病毒產(chǎn)生的抗體水平高于口服活病毒所產(chǎn)生的抗體水平，且每7d免疫能更好的誘導乳豬產(chǎn)生IgG抗體，并在21d時抗體水平達到最高。
　　本試驗成功分離得到了一株輪狀病毒四川毒株，并對其VP7基因進行克隆測序和分析。將其對4日齡的乳豬