豬傳染性胃腸炎病毒LJ-12株的分離及鑒定.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）作為一種病原引起豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)。該病在臨床診斷方面的主要病理特征表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉和嚴(yán)重脫水，屬于豬的一種高度接觸性和急性傳染病。本病對(duì)各年齡段的豬都易感，可引起兩周齡以下的仔豬死亡，致死率高達(dá)100％。該病流行范圍廣，發(fā)病和致死率極高，是我國及世

2、界其他國家仔豬死亡的重要疫病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)TGE的防制主要以疫苗免疫預(yù)防為主。由于TGEV分離培養(yǎng)相對(duì)困難，初代分離的病毒難以適應(yīng)細(xì)胞，病毒繁殖滴度低及產(chǎn)量低，是目前對(duì)該病毒研究所面臨的主要問題，因此流行毒株的分離培養(yǎng)并獲得穩(wěn)定適應(yīng)細(xì)胞的TGEV地方毒株，是研制TGE疫苗的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)對(duì)黑龍江省某豬場(chǎng)腹瀉仔豬的糞便通過核酸提取及RT-PCR鑒定，用TGEV的S基因引物擴(kuò)增到一段約480bp的基

3、因序列，同時(shí)用PRV及PEDV的引物進(jìn)行RT-PCR沒有擴(kuò)增到目的基因，將擴(kuò)增到的目的基因測(cè)序，結(jié)果表明該基因序列與TGEV TH-98株的S基因核苷酸序列同源性為98.5％，表明發(fā)病豬場(chǎng)腹瀉仔豬的糞便中含有TGE病毒。將該糞便病料經(jīng)離心、過濾后進(jìn)行病毒分離，在原代豬腎和豬睪丸細(xì)胞上分別盲傳8代后細(xì)胞出現(xiàn)病變;通過超薄切片電鏡觀察，普通電鏡觀察，免疫電鏡觀察確定了該病毒的形態(tài)是有囊膜的冠狀病毒，直徑大小在80～100 nm，將該病毒分離

4、株命名為TGEV LJ-12株。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，間接ELISA實(shí)驗(yàn)可見盲傳9代后的細(xì)胞培養(yǎng)毒均出現(xiàn)了特異性的陽性反應(yīng)。通過提取病變細(xì)胞培養(yǎng)液中的病毒RNA，使用套式PCR方法擴(kuò)增出TGE病毒S基因的一段長(zhǎng)約384bp的序列，將序列與GenBank上發(fā)表的多株流行毒株進(jìn)行比較，可見TGEV LJ-12株該段基因的核苷酸序列同源性均達(dá)到94％以上。
　　 根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒基因序列，使用套式PCR方法，設(shè)

5、計(jì)了針對(duì)N基因的特異性外套引物P1/P2，內(nèi)套引物N1/N2和N3/N4，P1/P2擴(kuò)增長(zhǎng)度為1167 bp，N1/N2和N3/N4分別為475 bp和476bp。對(duì)原代豬腎細(xì)胞繁殖的TGEV LJ-12株病毒進(jìn)行RT-nested-PCR檢測(cè)，通過DNAStar軟件與多株序列比較，結(jié)果顯示擴(kuò)增得到的TGEV LJ-12株N基因的兩段序列同源性均達(dá)到94％以上，經(jīng)原代豬腎細(xì)胞繁殖至20代仍可以檢測(cè)到，表明該病毒已經(jīng)分離成功并已適應(yīng)在原代

6、細(xì)胞上繁殖。
　　 應(yīng)用經(jīng)原代豬腎細(xì)胞繁殖至15代的細(xì)胞培養(yǎng)毒進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)剛出生未哺乳的SPF巴馬香豬灌服20 mL細(xì)胞培養(yǎng)毒，實(shí)驗(yàn)豬在第8天死亡，對(duì)其糞便和小腸進(jìn)行RT-nested-PCR方法檢測(cè)，可見攻毒仔豬從第三天開始排毒，糞便中可檢測(cè)到特異性的RT-PCR反應(yīng)帶，均在內(nèi)套PCR出現(xiàn)與預(yù)期結(jié)果相符合的約475 bp的N基因目的條帶。測(cè)序結(jié)果表明，與灌服之前的細(xì)胞培養(yǎng)毒的基因序列比較，序列未發(fā)生變化;通過免疫熒光檢測(cè)方