豬傳染性胃腸炎病毒全基因組克隆及N蛋白的表達(dá).pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(transimissible gastroenteriis virus，TGEV)感染2周齡以內(nèi)仔豬，死亡率可達(dá)100％，每年冬季豬傳染性胃腸炎(TGE)的流行給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的危害。TGEV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，基因組為單股正鏈RNA，具有感染性，全長約28.5 kb，5’端20 kb編碼病毒的復(fù)制酶多聚蛋白，3’端約8.3 kb包括通過亞基因組RNA表達(dá)的全部基因組，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(S、sM、M、N)和4

2、種非結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白在病毒的生活周期中都具有重要的作用。 對TGEV地方分離株基因組的全面了解和重要蛋白的表達(dá)研究有利于揭示該病毒的分子遺傳背景和分子致病機(jī)制，為TGEV的病原分子生物學(xué)、診斷學(xué)和基因組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。本文根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒的生物學(xué)特征，分離l株TGEV毒株，命名為SC-Y株；采用RT-PCR技術(shù)分段克隆了SC-Y株基因組全長cDNA：并對重要的結(jié)構(gòu)蛋白-N蛋白進(jìn)行了表達(dá)研究。 將疑似感染TGEV的

3、仔豬腹瀉病料勻漿，取上清液接種ST細(xì)胞，待盲傳至第8代，ST細(xì)胞可出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，收集第8代接毒細(xì)胞制備細(xì)胞飛片，通過直接熒光抗體技術(shù)在接毒的細(xì)胞漿中觀察到了特異性的免疫熒光，收集接毒細(xì)胞制備電鏡超薄切片，在透射電子顯微鏡下觀察到了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的病毒樣粒子。參照GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的T014株、purdue-115株、purdue株和TS株N基因序列設(shè)計引物，從接毒細(xì)胞中擴(kuò)增出了預(yù)期長度的TGEV N基因片段，將其克隆入PMD18-

4、T載體中，序列測定表明，SC-Y株N基因全長1149 bp，與GenBank中已有的TGEV N基因序列核苷酸同源性均在95.0％以上。 根據(jù)NCBI已公布的豬傳染性胃腸炎病毒的基因組序列，結(jié)合多個毒株基因、組的限制性內(nèi)切酶酶譜分析，設(shè)計了16對引物，以SC-Y株感染的豬睪丸細(xì)胞(ST)總RNA為模板，用.RT-PCR方法擴(kuò)增得到16個cDNA片段，經(jīng)克隆、測序并拼接后獲得了覆蓋該病毒基因組全長cDNA序列，SC.Y株基因組全長

5、28590 bp，包含7個閱讀框，5’端非編碼區(qū)長31 5 nt，3’端非編碼區(qū)長277 nt，與GenBank中收錄的其它6株’I~GEV分離株的全基因組序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明SC-Y與PIJR46-MAD株核苷酸同源性最高，達(dá)99.7％，’FGEV系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，SC-Y株與美國Purdue株可能來源于共同的祖先。 以8個cDNA陽性質(zhì)粒為材料，利用相鄰片段之間的酶切位點及長鏈PCR技術(shù)獲得了3個5 kb左右的cDNA片段，

6、再以感染SC-Y株的ST細(xì)胞總RNA為模板，利用RT-PCR擴(kuò)增了2個6 kb左右cDNA片段，覆蓋TGEV基因組的重疊cDNA片段A、B、C、D和E大小分別為6228 bp、5247 bp、5275 bp、6911bp和5115 bp，將它們分別克隆入PTA2載體，為構(gòu)建豬傳染性胃腸炎病毒的全長cDNA克隆提供了條件。 應(yīng)用分子生物學(xué)軟件分析了豬傳染性胃腸炎病毒分離株SC-Y的基因組密碼子使用特點，結(jié)果顯示，TGEV對以T和A

7、結(jié)尾的密碼子存在輕微的偏愛性，選擇真核表達(dá)系統(tǒng)，尤其是酵母系統(tǒng)，更適合TGEV基因的表達(dá)。各基因片段核苷酸同源性比較表明，SC-Y株的ORF3a和ORF3b與其他分離株相應(yīng)片段差異明顯，ORF1b相對保守，同源性均在98.9％以上。在TGEV四種結(jié)構(gòu)蛋白中，N蛋白的氨基酸變異率最低，為2.14‰。對基因組非編碼區(qū)二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，不同分離株間存在差異。 對已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pMDl8-N通過Bspll9l和Xho I雙酶切后

8、，得到TGEV N基因，將其亞克隆入原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，在IPTG的誘導(dǎo)下，N基因以融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)，通過重組質(zhì)粒表達(dá)條件的優(yōu)化，確立了N蛋白表達(dá)時的最佳誘導(dǎo)物濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)時間為4 h，誘導(dǎo)溫度為25℃。以純化的融合蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，摸索了抗原最佳包被濃度為15μg/ml，抗體稀釋度1:40，最適封閉液為5％FBS，血清反應(yīng)時間為90 min，酶標(biāo)二抗HRP-SPA的工作濃度為1:5000，